土壤中產(chǎn)α-淀粉酶菌株的分離和篩選

楊 楊，劉畢琴，張 發(fā)，廖光輝，楊曉燕

（大理學院農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003）

α-淀粉酶（α-amylase），編號：EC 3.2.1.1，作用于淀粉時從淀粉分子的內部隨機切開α-1，4糖苷鍵，是一種只能催化水解直鏈淀粉的液化酶〔1〕。通常采用酶活力（enzyme activity）來表示酶催化一定化學反應的能力〔2〕。一般情況下，α-淀粉酶的作用溫度范圍60～90℃，最適宜作用溫度為60～70℃，作用pH值范圍5.5～7.0，最適pH值為6.0。α-淀粉酶主要存在于人的唾液和胰臟中，也存在于麥芽、蟑螂涎腺、芽孢桿菌、枯草桿菌、黑曲霉和米曲霉中。α-淀粉酶酶制劑大量應用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等，占酶制劑市場份額的25%左右〔3-4〕。目前，工業(yè)生產(chǎn)上都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)α-淀粉酶，最常用的方法是從自然界中篩選出可以產(chǎn)這種酶的目的菌種，大致可以分為以下4個步驟：采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離和性能測定〔5-6〕。土壤是微生物生活的大本營，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到期望中的菌株，再對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)出所需的酶〔7〕。由于我國的α-淀粉酶制劑的品種和生產(chǎn)菌株都很單一，α-淀粉酶酶活力相對于國外同行業(yè)的較低〔8〕。本研究旨在從富含淀粉類物質的土壤中分離純化出產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，通過水解圈直徑和菌落直徑的比值，結合酶活力大小進行比較，篩選出產(chǎn)酶活力較強的菌株，并對其所產(chǎn)的酶進行初步的酶學性質研究。研究結果可為α-淀粉酶的生產(chǎn)提供種質資源，同時也為生產(chǎn)實踐提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。

1 材料

1.1 樣品采集 土壤樣品分別采自大理學院校園面食食堂附近空地、晾曬谷物空地、食堂附近綠化帶和洗碗池旁，共4份，編號1～4。

1.2 培養(yǎng)基的制備

1.2.1 淀粉瓊脂培養(yǎng)基 2.0 g可溶性淀粉，10 g蛋白胨，5 g牛肉膏，5 g NaCl，加少量蒸餾水加熱溶解，然后稱量16 g瓊脂加入燒杯中溶化，補蒸餾水至1000 mL，再用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl，調節(jié) pH 至6.4〔9〕。

1.2.2 產(chǎn)α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基 22.5 g面粉、10 g牛肉膏、2 g NaNO3、1.5 g K2HPO4、0.5 g MgSO4、0.005 g FeS04·7H2O，補蒸餾水至500 mL〔10〕。

2 方法

2.1 α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離 在超凈工作臺上，各稱取土樣10 g，分別加入到裝有90 mL無菌水的滅菌三角瓶中，震蕩搖勻，置80℃水浴10 min，以倍比稀釋法分別制備10-4～10-6稀釋度的土壤懸液。用移液管從10-4、10-5、10-6這3個梯度的試管中取土壤懸液1 mL注入無菌培養(yǎng)皿中，然后加入適量經(jīng)過滅菌融化的淀粉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、冷卻、標記后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h〔9〕。待長出菌落后，將新碘標準液加入到生長最好的平板中，菌落周圍若形成水解圈，便是產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，測量這些菌株的菌落直徑和水解圈直徑，記錄編號。挑取有水解圈的單菌落，轉接平板，得到純種，繼續(xù)轉接于平板和試管斜面，37℃培養(yǎng)24 h后置4℃冰箱保藏，作為工作菌株備用。

2.2 α-淀粉酶的酶活力測定

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng) 找出每種菌株生長最好的稀釋度平板，將該稀釋度平板制成菌懸液。以接種量為4 mL，接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，最適發(fā)酵初始pH值為7，裝液量為40 mL。發(fā)酵溫度為33.5℃，搖床培養(yǎng)72 h，進行發(fā)酵培養(yǎng)〔11〕。

2.2.2 原酶液的制備 首先，采用硫酸銨沉淀法從發(fā)酵液中粗提取α-淀粉酶〔12〕。全部操作過程均在室溫下進行。每種菌株發(fā)酵液以4000 rmp離心10 min去菌體，所得上清液為粗酶液。粗酶液各取5 mL，分別同時加入1.87 g（NH4）2SO4細粉末，混勻，靜置30 min。以4000 rmp離心10 min，離心去除上清液保留沉淀，將沉淀在40℃下烘干，制成酶粉。再將0.1 g酶粉溶于1 mL無菌水，制成原酶液。

2.2.3 酶活力的測定 反應體系為5 mL 0.5%淀粉和0.5 mL稀釋了200倍的原酶液，pH值6.0，50℃下反應5 min后，加0.1 mol/L H2SO45 mL終止反應，取0.5 mL反應液加入5 mL Lugol氏碘液稀釋液，溶液顯色，在660 nm波長下測吸光度。查看吸光度與α-淀粉酶酶濃度對照表〔13〕，找出相應測試酶液的濃度，通過下面公式計算出樣品的酶活力。

公式：X=cn，

式中：X為樣品的酶活力〔U/g（U/mL）〕，

c為測試酶液的濃度（U/mL），

n為樣品的稀釋倍數(shù)。

2.3 α-淀粉酶產(chǎn)生菌的形態(tài)學觀察 將產(chǎn)酶活力最強的菌株接種于淀粉瓊脂培養(yǎng)基〔9〕，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落的形態(tài)特征，并通過革蘭氏染色和芽孢染色法對菌株進行形態(tài)學鑒定〔14〕。

2.4 α-淀粉酶學性質研究

2.4.1 α-淀粉酶最適反應溫度 分別取制備好的產(chǎn)酶活力最強菌株的發(fā)酵液5 mL，在溫度梯度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的情況下測定酶活力，以確定α-淀粉酶最適反應溫度。

2.4.2 酶反應最適pH值 反應體系的pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的緩沖液，再將0.1%可溶性淀粉作為底物，加入5 mL制備好的產(chǎn)酶活力最強菌株的發(fā)酵液反應5 min，測定酶活力，以確定該酶反應最適pH值。

3 結果

3.1 α-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選 從土壤樣品共分離到4株α-淀粉酶產(chǎn)生菌，水解圈測定結果見表1。由表1可見，菌株4的內外徑比值較大，為2.800。

表1 菌株水解圈直徑比較

3.2 α-淀粉酶的酶活力測定 菌株1～4的酶活力測定結果見表2。從表2可知，菌株4產(chǎn)酶活力最高。

表2 酶活力的計算結果

3.3 菌株4形態(tài)學特征 菌株4的菌落表面光滑，不透明，呈規(guī)則的圓形。菌體經(jīng)革蘭氏染色呈桿狀，為革蘭氏陽性菌。經(jīng)芽孢染色后菌體中可見綠色芽孢，故初步鑒定菌株4為芽孢桿菌。

3.4 α-淀粉酶酶學性質

3.4.1 菌株4產(chǎn)α-淀粉酶酶促反應最適溫度 結果見圖1。由圖1可知，菌株4產(chǎn)α-淀粉酶酶促反應最適溫度范圍為50～60℃

圖1 α-淀粉酶熱穩(wěn)定性

3.4.2 菌株4產(chǎn)α-淀粉酶酶促反應最適pH值 結果見圖2。由圖2可知，菌株4產(chǎn)α-淀粉酶酶促反應適合pH值范圍在4.0～7.5之間，最適pH值為6.2。

圖2 不同pH值反應體系中對酶活力的影響

4 討論

菌株4所產(chǎn)酶的酶活力最強，其所在土壤表層含淀粉類物質最多，水分充足。推測這樣的土壤適合產(chǎn)淀粉酶活力較強的菌株的生長。

在測定α-淀粉酶酶活力時常采用白瓷板目視比色法。該方法是以酶與淀粉的呈色反應為基礎，肉眼觀察酶反應的終點，直接根據(jù)公式計算酶活力。雖然此方法簡便快速，但是在確定反應終點時，由于主觀因素的影響會造成誤差，并且標準色的不穩(wěn)定性以及色澤與反應液的不一致，都將影響酶活力最終計算結果。因此，本實驗在測定α-淀粉酶酶活力時均采用分光光度計法，此方法克服了白瓷板目視比色法的各種缺點。同時應用（NH4）2SO4鹽析法，粗提取α-淀粉酶，將該酶稀釋200倍，吸光度便調整到了0.178～0.425范圍內，可以查看吸光度與α-淀粉酶酶濃度對照表〔14〕，計算酶活力，這樣更準確可靠。

〔1〕張馳，陳固.甘薯果脯加工工藝研究〔J〕.食品研究與開發(fā)，2001，22（6）：28-30.

〔2〕郭勇.酶工程原理與技術〔M〕.北京：高等教育出版社，2010：8-9.

〔3〕孫曉菲，李愛江.α-淀粉酶的應用及研究現(xiàn)狀〔J〕.畜牧獸醫(yī)科技信息，2008（6）：13-14.

〔4〕羅志剛，楊景峰，羅發(fā)興.α-淀粉酶的性質及應用〔J〕.食品研究與開發(fā)，2007，28（8）:163-167.

〔5〕谷軍.α-淀粉酶的生產(chǎn)與應用〔J〕.生物技術，1994，4（3）：1-5.

〔6〕唐嘉，陳朝銀，夏靜，等.一種初篩產(chǎn)胞外淀粉酶菌株的簡化方法〔J〕.生物加工過程，2008，6（1）：1.

〔7〕燕衛(wèi)東.貧瘠土壤中淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選〔J〕.中國釀造，2008（12）：73-74.

〔8〕楊自明，張金輝，蘇靜，等.一株黑曲霉所產(chǎn)α-淀粉酶的提取及其特性研究〔J〕.河南職工醫(yī)學院學報，2006，18（6）：431．

〔9〕石飛虹，周友超，郭翠，等.工業(yè)生產(chǎn)中耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究〔J〕.食品與機械，2009，25（5）：54-56.

〔10〕安弋，劉新育，劉亮偉，等.1株酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（4）：1709-1711.

〔11〕朱中南，鄭毅，章淑妹.α-淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化〔J〕.海峽科學，2011（12）：22-25.

〔12〕姜永明，隋德新，史永昶.枯草芽孢桿菌86315α-淀粉酶的研究、分離提純、性質及動力學〔J〕.江蘇農(nóng)學院學報，1992，13（2）：15-20.

〔13〕全國食品發(fā)酵標準化中心.工業(yè)用酶制劑行業(yè)標準資料匯編〔M〕.1993:37-44.

〔14〕沈萍，陳向東.微生物學實驗〔M〕.北京：高等教育出版社，2007:187-190.