污水中解有機磷細菌的篩選及解磷能力測定

郭 樂，申元英,2*

（1.大理學院公共衛生學院，云南大理 671000;2.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000）

有研究表明，磷是水體富營養化的主要限制因子〔1〕。水環境中的磷主要來自生活污水、工業廢水和農業排水。人體代謝廢物、含磷合成洗滌劑的大量使用，化肥、農藥、水處理的廢水含磷量均較高。廢水經生化處理后，剩余的大部分磷隨排水進入河道，這是城市附近河道中磷的主要來源〔2〕。農田中使用的磷肥，除被植物吸收利用的部分外，其余的相當部分通過雨水沖入水體。家畜家禽的廢棄物及排泄物中的大量有機磷，隨著雨水的沖刷進入水體。水體中磷逐漸增多，造成水體富營養化。近年來研究〔3-4〕發現，微生物也是控制和影響磷釋放的重要因素，可直接參與水體中磷的循環，把不溶的有機磷化合物轉化為可溶性磷，并可固定大量的磷在細菌細胞內〔5〕。本次研究從污水中分離純化得到能夠降解有機磷的細菌，篩選高效的有機磷降解菌，研究其解磷能力，為污水中的生物除磷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 采集污水處理廠濃縮池水樣，裝入250 mL滅菌采樣瓶中。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基 試驗所需微生物培養基如下：

（1）富集培養基：牛肉膏蛋白胨液體培養基，為了使解有機磷細菌在培養基中形成生長優勢，在培養基中加入適量卵黃液。

（2）有機磷固體培養基〔6〕：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min）冷卻至50℃以下，立即加入60 mL卵黃稀釋液，倒平板。其中，卵黃稀釋液的制備〔7〕：用75%酒精擦拭雞蛋外殼，敲破雞蛋一端，流去蛋清后將蛋黃流入已滅菌的錐形瓶中，按1：1比例加入無菌生理鹽水，搖勻。

（3）蒙金娜培養基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO40.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，蒸餾水1000 mL，115 ℃滅菌30 min。

（4）有機磷液體培養基〔7〕：向1000 mL蒙金娜培養基中加入0.4 g酵母膏，再加入0.2 g用無水乙醇溶解過濾的卵磷脂。

1.2.2 解有機磷細菌的分離及純化 用無菌移液管吸取5 mL水樣加入到裝有100 mL富集培養基的250 mL錐形瓶中，于30℃、130 r/min的恒溫水浴搖床上富集培養5 d。

常規10倍稀釋法稀釋樣品，分別從各個濃度的菌懸液中吸取0.1 mL，用涂布棒均勻涂布在有機磷固體平板上，每個稀釋度做3個重復，以大腸埃希菌作為陰性對照。于30℃恒溫培養箱中培養2 d，能產生透明溶磷圈的即為解有機磷細菌。挑取有機磷細菌，分區劃線接種在有機磷固體平板上進行純化，將純化后的細菌接種在斜面培養基中，4℃冰箱保種。

1.2.3 解有機磷細菌的篩選及解磷能力測定 有機磷固體平板解磷能力測定〔8〕：將分離純化后的菌株分別用接種針點接種在有機磷固體平板上，培養10 d，觀察溶磷圈的大小，分別測量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計算D/d的比值。

有機磷液體培養基中解磷能力測定：分別將菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于30℃、130 r/min，水浴恒溫搖床上搖18 h，得到菌懸液。將1 mL的菌懸液轉移至裝有50 mL滅菌的蒙金娜有機磷液體培養基中，于30℃、130 r/min的水浴恒溫搖床上培養7 d，采用過硫酸鉀-鉬銻抗分光光度法〔9〕連續7 d監測水樣中水溶性磷含量。

2 結果

2.1 解有機磷細菌的分離純化 從污水處理廠濃縮池采集的水樣，通過富集培養后，得到解有機磷細菌共19株。將平板上產生溶磷圈的解有機磷細菌進過多次的分離純化，在分離純化過程中，其中的5株喪失解磷能力，最終得到具有降解卵磷脂能力的細菌共14株。

2.2 平板法測定菌株解磷能力及優勢菌株的篩選將獲得的14株解有機磷細菌分別用接種針點接種于單個的有機磷平板上（90 mm平板），在30℃的恒溫培養箱中培養10 d。觀察并測量溶磷圈大小及菌落大小，篩選其中溶磷圈較大的4株細菌做后續定量測定，見表1、圖1。

表1 平板法測定解有機磷細菌的解磷能力

圖1 OPB8、OPB15菌株溶磷圈的測定

由表1可以看出，通過10 d的培養，篩選出4株解磷能力強的菌株。其中OPB8菌株的溶磷圈最大，而其溶磷圈直徑與菌落大小直徑比例較小，OPB15號菌株溶磷圈稍小，但其比例最大。OPB17、OPB19解磷能力次之。上述4株細菌的在平板上的產生的溶磷圈大小均大于其余菌株，根據溶磷圈大小，只能初步測定解有機磷細菌的解磷能力，為了了解其分解有機磷的趨勢，本試驗采用液體培養法對其解磷能力進行了測定。

2.3 液體培養法測定解磷能力 由表2可見，連續7 d的監測培養液中水溶性磷含量，OPB17、OPB19菌株達到解磷峰值時，培養液中的水溶性磷含量達到8.11 mg/L和9.17 mg/L，解磷率分別為107.9%和135.1%，隨著培養時間的延長，培養液中的水溶性磷含量降至6.52 mg/L、5.46 mg/L，但均比原培養液中的水溶性磷含量多。OPB15、OPB19菌株達到解磷峰值時，培養液中的水溶性磷含量達到5.14 mg/L和13.62 mg/L，解磷率分別為31.8%、249.2%。但7 d培養結束后，培養液中的水溶性磷含量降至1.43 mg/L和0.58 mg/L。使培養液中的水溶性磷含量分別降低了72.2%和95.7%。

表2 解有機磷細菌解磷能力（7 d）

2.4 解有機磷細菌解磷曲線 如圖2所示，篩選出的4株解有機磷細菌對卵磷脂中磷的釋放高峰在第3～4天，隨后水溶性磷含量逐漸下降，這可能是菌體利用了分解出的無機磷。

圖24株細菌解磷曲線

3 結論

從以上結果可以看出，從污水中分離出能夠降解有機磷的細菌的解磷能力不同，其培養液中水溶性磷含量均表現為先升高后降低，說明這些菌株不但有分解有機磷的能力，還具有吸收、利用和儲存磷的能力。

4 討論

本次實驗分離純化篩選的4株細菌菌落直徑均較大，可能與培養基中含有充足的卵磷脂有關。OPB8菌株的溶磷圈最大，但在液體培養基中的解磷能力降低，OPB19菌株的溶磷圈最小，但在液體培養基中的解磷能力最大，這可能與細菌分泌的解磷酶與有機磷的接觸及培養條件有關〔10〕。趙小蓉等〔11〕認為，解有機磷細菌在分解化合物時，一部分磷被同化為細菌自身的有機磷，另一部分以磷酸鹽狀態儲存在細菌細胞內。另有報道〔12〕指出，細菌生長到達靜止期后，能吸收環境中的磷，以多聚磷酸鹽的形式（異染顆粒）儲存在細菌細胞內。本次實驗中，4株解有機磷細菌的培養液中水溶性磷含量均有下降，可能與細菌生長利用了培養液中水溶性磷有關。本次試驗為進一步研究解有機磷細菌的解磷機制及模擬實驗奠定基礎。

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