表達hTERT的大鼠骨髓間充質干細胞生物學特性研究

馬迪 嚴佶祺 彭承宏 施敏敏 陳雪華 王維杰 李宏為

研究表明，骨髓間充質干細胞 （Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）已成為組織工程以及細胞移植治療中的重要種子細胞，具有廣闊的應用前景[1-2]。但是，由于Hayflick界限的存在，BMSCs會隨著細胞的分裂出現衰老現象，嚴重影響其在組織工程及細胞移植治療領域的作用。

隨著對人端粒酶逆轉錄酶 （Human telomerase reverse transcriptase，hTERT）的深入研究，導入外源性的hTERT可使細胞的增殖能力、抗衰老能力得到增強，甚至獲得永生化的能力[3]。將本研究前期已成功構建并包裝獲得的含hTERT的重組慢病毒液[4]，感染大鼠BMSCs，觀察細胞體外增殖分裂情況及其多向分化潛能，為組織工程及細胞移植治療建立穩定的種子細胞儲備。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

P3大鼠BMSCs（上海消化外科研究所提供）；10%FBS、L-DMEM細胞培養基 （美國Gibco公司）；PBS（生工生物工程股份有限公司）；PE標記CD29抗大鼠抗體、CD90抗大鼠抗體 （美國BD公司）；PE標記CD34抗大鼠抗體 （美國Santa Cruz公司）；PE標記CD45抗大鼠抗體（美國Biolegend公司）；成脂誘導分化試劑盒、成骨誘導分化試劑盒（廣州賽業生物科技有限公司）；Trizol（美國Life Technologies公司）；ReverTra Ace QPCR RT Kit、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本 TOYOBO公司）；polybrene（美國 Sigma 公司）。

臺式離心機5810R （德國Eppendorf公司）；倒置熒光顯微鏡 IX-71（日本 Olympus公司）；BD FACS Calibur流式細胞儀 （美國BD公司）；定量PCR儀（瑞士Roche公司）；全光譜微孔板分光光度計（美國BIOTEK公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組病毒液感染大鼠BMSCs

參照文獻[4]方法，構建并獲取含hTERT基因的重組慢病毒液，胰酶消化并調整大鼠BMSCs密度為2×104個/孔，加入24孔板，培養24 h后進行病毒感染。一個24孔板內按照每孔10 μL加入重組慢病毒液，另一個24孔板每孔加入空病毒10 μL，于各孔內分別加入polybrene，并調整終濃度為8 μg/mL，同時設置未感染組，分別命名為MSC-hTERT組、MSC-GFP組和MSC組，繼續培養箱內培養。感染24 h后更換為含血清完全培養液，待熒光表達穩定后常規消化收集MSC-hTERT組及MSC-GFP組細胞，轉入6孔板內繼續體外增殖培養；同時，收集MSC組細胞，轉入6孔板內同期體外增殖培養，觀察各組熒光表達情況、細胞形態和傳代情況。

1.2.2 hTERT基因mRNA水平的表達

收集各組細胞，分別加入Trizol，抽提總RNA，調整RNA濃度為0.5 μg/μL，按照 ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書進行逆轉錄反應。根據hTERT的基因序列 （NM_198253.2），設計引物。F：5'GAGAACAAGCTGTTTGCGGG3'；R：5'AAGTTCACCACGCAGCCATA3'。

收集各組細胞cDNA，按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix說明配置反應體系，并進行Real-Time PCR檢測目的基因的mRNA表達，以2-△Ct作為基因表達量，分析各組目的基因的表達情況。

1.2.3 MSC-hTERT組細胞周期的檢測

取對數生長期的MSC-hTERT及MSC組細胞，常規胰酶消化收集，4℃離心后棄去上清，PBS適度吹打重懸。加入-20℃預冷的75%乙醇，吹打均勻，制成單細胞懸液，4℃固定24 h；隔日1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS漂洗，適度吹打重懸，加入PI和RNA酶，并調節PI終濃度為20 μg/mL，RNA 酶終濃度為 50 μg/mL，37 ℃孵育 30 min，流式細胞儀檢測分析細胞周期，并利用自帶軟件進行數據分析。

1.2.4 MSC-hTERT組細胞表型的鑒定

取對數生長期的MSC-hTERT組細胞，消化、離心后， 進行 CD29、CD34、CD45、CD90 抗體標記，流式細胞儀檢測細胞表型。

1.2.5 MSC-hTERT的成脂誘導及檢測

胰酶消化對數生長期的MSC-hTERT組細胞，設置誘導組及對照組，誘導組按照成脂誘導試劑盒說明書添加誘導液進行成脂誘導，對照組添加含10%FBS的L-DMEM培養液。待細胞內脂滴出現后進行油紅O染色，顯微鏡下觀察，鑒定其成脂分化能力。

1.2.6 MSC-hTERT的成骨誘導及檢測

胰酶消化對數生長期的MSC-hTERT組細胞，設置誘導組及對照組，誘導組按照成骨誘導試劑盒說明書添加誘導液進行成骨誘導，對照組添加含10%FBS的L-DMEM培養液，誘導3周后進行茜素紅染色，顯微鏡下觀察，鑒定其成骨分化能力。

1.2.7 統計學分析

采用SPSS16.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，兩組以上采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSC-hTERT組細胞熒光檢測結果

感染重組慢病毒液后72 h，在熒光顯微鏡下及倒置相差顯微鏡下，觀察細胞形態和熒光表達情況，熒光表達率約為75%。光鏡下觀察發現，細胞仍保持長梭形外觀和貼壁能力（圖1）。

圖1 重組慢病毒液感染后大鼠BMSCs（左：光學顯微鏡，40×；右：熒光顯微鏡， 40×）Fig.1 Morphological observation of rat BMSCs infected by recombinant virus supernatant.(Left:Light microscope,40×;Right:Fluorescence microscope,40×)

2.2 Real-Time PCR檢測hTERT基因的表達

MSC-hTERT組的hTERT基因mRNA表達明顯高于MSC組和MSC-GFP組，差異顯著（P<0.05）。MSC組與MSC-GFP組hTERT基因表達量無明顯差異（P>0.05）（圖 2）。

圖2 各組hTERT基因的mRNA相對表達量Fig.2 The relative expression of hTERT mRNA in three groups

2.3 MSC-hTERT細胞周期檢測及體外傳代觀察

采用流式細胞儀進行細胞周期的檢測，比較MSC組及MSC-hTERT組細胞周期檢測結果，顯示MSC-hTERT組細胞G2期和S期細胞，較MSC組明顯增多，增殖指數明顯上升，分裂增殖潛力提升。體外傳代觀察發現，MSC-hTERT組細胞傳代次數增多，細胞壽命較MSC組延長，且細胞形態得到較好保持（圖 3）。

圖3 MSC組及MSC-hTERT組細胞周期檢測Fig.3 Cell cycle analysis of MSC group and MSC-hTERT group

2.4 MSC-hTERT組細胞表型檢測

MSC-hTERT組CD29及CD90的陽性表達率分別高達99.83%和99.53%，而CD34及CD45的陽性表達率僅為0.05%和0.13%（圖4）。

圖4 MSC-hTERT組細胞表型的流式細胞儀檢測結果Fig.4 The expression of surface markers in MSC-hTERT group detected by FCM

2.5 MSC-hTERT組分化潛能檢測

通過成脂、成骨誘導以及特異性染色檢測，MSC-hTERT組細胞仍然保持了多向分化潛能，在特異性誘導劑的作用下，可向脂肪細胞以及成骨細胞方向轉化，而對照組均未見陽性染色結果（圖5）。

圖5 MSC-hTERT組細胞成脂及成骨分化誘導結果（左：油紅O 染色， 200×；右：茜素紅染色， 200×）Fig.5 Histological observation of cells in MSC-hTERT groups after adipogenic and osteogenic induction(Oil red O staining,200×;Alizarin red staining of group,200×)

3 討論

BMSCs具有很強的自我增殖能力，且能分泌很多細胞因子，經誘導可向成骨細胞、脂肪細胞、神經樣細胞[5]、血管內皮細胞[6]等分化，并行使相應功能，但由于缺乏端粒酶活性，其生存時間以及分化能力會隨著細胞的增殖分裂而受到影響。hTERT決定著人端粒酶的活性。研究表明，轉入外源性的hTERT可以提高細胞端粒酶活性[7]，使細胞增殖分裂能力增強，甚至可使細胞永生化。因此，通過外源性轉入hTERT基因，恢復或者增加細胞的端粒酶活性，構建穩定表達hTERT的細胞系，對于維持BMSCs的分化增殖能力、延長壽命提供了新的方向，有望為組織工程和細胞移植治療儲備具有旺盛增殖能力的種子細胞。

本研究運用前期實驗獲得的重組慢病毒液和空病毒液，分別感染大鼠BMSCs，發現MSC-hTERT組能穩定表達綠色熒光，并且其hTERT基因的mRNA表達明顯高于MSC組及MSC-GFP組，差異具有統計學意義（P<0.05）；而在細胞周期的檢測中，MSC-hTERT組的細胞增殖指數相較于MSC組有明顯上升，提示具有復制潛力和分裂能力的細胞明顯增多；而體外傳代次數的增加，以及細胞形態能夠在較長時間內保持原有特征等結果，也提示了異位表達hTERT能夠上調細胞周期，通過DNA修復基因，使得細胞具有繞過危機期、延長壽命的能力[8]。

實驗中所選用的細胞是否保持其原有生物學特性對于實驗結果具有重要意義，由于不具備特異性表面標記分子，對MSCs的直接鑒定通常存在一定困難[9]，本實驗對MSC-hTERT組細胞進行了細胞形態、細胞表面標記物及定向分化能力的檢測，結果顯示MSC-hTERT組細胞仍能保持長梭形外觀，并能夠表現出BMSCs特有的貼壁能力，同時高表達CD29及CD90，低表達CD34及CD45，符合骨髓源性間充質干細胞的特性。在定向分化研究中，轉染hTERT的BMSCs在誘導因子作用下能夠顯示出向骨細胞以及脂肪細胞分化的特性，提示MSC-hTERT具有與原代培養BMSCs相同的體外分化潛能。

本研究利用慢病毒載體將hTERT基因成功導入大鼠BMSCs并成功構建MSC-hTERT，細胞的增殖分裂能力得到明顯加強，且仍然保持與BMSCs相同的生物學特性，可為組織工程研究及細胞移植治療提供可靠的種子細胞。

雖然hTERT介導的永生化細胞系成瘤風險更低，但是基因改造后細胞可能存在的潛在致瘤性還是不容忽視的。已有研究提示，端粒酶活性已成為腫瘤檢測的一個新標志[10]，同時異常表達的hTERT與多項腫瘤成正相關[11-12]。因此，轉染hTERT的大鼠BMSCs的成瘤風險評估，以及相關體內實驗，是進一步研究的重點。

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