血清脂肪素濃度及基因多態性與冠狀動脈鈣化的相關性

王 濤 馬曉靜 李春梅 張興華 (山東大學附屬省立醫院心內科，山東 濟南 250021)

冠狀動脈粥樣硬化是作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的基本病變，而冠狀動脈鈣化(CAC)則是其標志和早期征象之一，檢測CAC并作分析，對于發現冠狀動脈粥樣硬化的存在，并在一定范圍內提示硬化程度有著重要臨床意義〔1〕。visfatin是Fukuhara等〔2〕于2005年發現的一種新的脂肪因子，能發揮類似于胰島素的作用，降低血糖〔3〕;并能促進脂肪細胞的合成和儲積〔4〕。目前關于visfatin基因多態性的研究尚少。本研究擬觀察血清visfatin濃度及 rs61330082與rs2058539基因位點在山東省漢族人群當中是否存在遺傳變異，及與CAC的發病是否存在相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 實驗組:選擇2010年9月至2012年3月期間于山東省立醫院心血管中心住院患者且經冠狀動脈造影檢查明確診斷為CAC共138例患者，均為漢族人群，相互間無血緣關系。MCG:男，40例，女26例，共66例，平均年齡(60.78±9.31)歲;MSCG:男，45例，女 27例，共 72例，平均年齡(65.98±12.87)歲。排除標準:①糖尿病;②近1個月內出現急慢性感染;③3個月內外科手術，創傷;④慢性結締組織病及心臟瓣膜等疾病患者;⑤腫瘤;⑥嚴重肝腎功能不全。冠狀動脈造影方法:采用經右股動脈Judkins方法，每一支血管至少有2個以上體位投影，結果由多年從事介入治療的有經驗的主任醫師判斷。CAC的診斷標準:根據鈣化的嚴重程度，可分為以下4級〔5〕:無鈣化:未發現任何陰影;輕度鈣化:只有在心臟跳動時看到很輕，模糊的跳動的陰影，心臟不跳動時完全看不到陰影的存在;中度鈣化:在心臟跳動時看到較清楚、較容易看到的陰影;心臟不動時看不到陰影的存在;重度鈣化:在心臟跳動和不動時均可清楚地看到陰影的存在。對照組:68例均行冠狀動脈造影檢查，檢查方法同上，排除CAC，及冠狀動脈粥樣硬化且肝腎功能、心臟彩超及心電圖均正常。男40例，女28例，平均年齡(64.73±9.98)歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 PCR熱循環儀(Applied Biosystems9700型基因擴增儀);圖像分析儀(AlphalmagerTm2200);低溫高速離心機(美國基因有限公司);電泳儀(北京六一儀器廠)人類基因組DNA提取盒(TIANGEN)，限制性內切酶(Fermentas及 NEB)。

1.2.2 標本采集及DNA的提取 所試對象均為冠脈造影術后明確診斷患者，均禁食12 h，過夜后于次日清晨空腹抽取靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，取全血2 ml用人類基因組DNA提取試劑盒提取外周靜脈血白細胞，嚴格按照血液基因組DNA提取試劑盒要求提取DNA，提取DNA于－80℃冰箱凍存，剩余全血于離心機3 000 r/min，離心10 min后取上清，于－80℃冰箱凍存，以檢測血清visfatin的濃度。

1.2.3 血清visfatin濃度的測定 血清visfatin檢測選用Blue-Gene公司提供visfatin檢測試劑盒，采用酶聯免疫法(ELISA)進行visfatin的檢測，嚴格按照說明書進行操作，由Alisei全自動酶免疫分析系統分析。

1.2.4 目的基因擴增(PCR反應) 引物通過生工生物工程(上海)有限公司設計并合成，rs61330082位點上游引物:CCGGTAAAACACAGGGAAGAT， 下 游 引 物:ATTCTATCTGGGGGCAGTGAT。rs2058539位點上游引物 TTAACTTTGGTATTCTTGCCACT，下 游 引 物 CAAAAATCCCCCAATTTCTGT。PCR 反應條件:反應體系均為 50 μl，上下游引物各 1 μl，Taq 酶0.25 μl;10 × pcr Buffer 5 μl模板 DNA1 μl，ddH2O 補充體積至50 μl。循環參數:95℃預變性5 min后，進入主循環(94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min)×35 個循環，72℃終末循環5 min，置4℃終止反應。取5 μl的PCR反應產物與1 μl上樣緩沖液在與1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得產物長度分別為 344 bp，273 bp。見圖 1。

1.2.5 酶切反應 PCR產物體系30 μl酶切體系，限制性內切酶 MvaI 1.0 μl;10 × FastDigest Green Buffer 2.0 μl;rs66130058位點 PCR 產物 10 μl;ddH2O 17 μl補充體積至30 μl，離心均勻后，置37℃水浴充分酶解10 min。限制性內切酶 HphI 0.5 μl;10 × NEB 緩沖液 2.0 μl;rs2058539 位點 PCR產物 10 μl;ddH2O7.5 μl補充體積至 20 μl，離心均勻后，置37℃水浴充分酶解20 min。

1.2.6 酶切產物鑒定 取6 μl已含上樣緩沖液的PCR產物，加入2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，以DNA marker為參照。于110 W電壓電泳后，在凝膠成像儀下觀察基因并照相。見圖2～圖5。

1.2.7 生化指標 全自動生化分析儀檢測血脂，血糖，C-反應蛋白等。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件分析，計量資料均以±s表示，單本均數比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。所有顯著性檢驗均采用雙側檢驗。

圖1 visfatin基因不同位點PCR產物

圖2 visfatin基因rs61330082位點CT型

圖3 visfatin基因rs2058539、rs61330082位點CC、TT型

圖4 visfatin基因rs20585391位點AA型

2 結果

2.1 各組臨床資料比較 年齡、性別、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、C-反應蛋白相比較均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 各組血清Visfatin濃度的比較 MSCG患者的血清visfatin顯著高于 CCNCG〔(32.33±9.45)vs(25.48±3.28)ng/ml，P＜0.01〕。MSCG患者的血清 visfatin水平顯著高于 MCG〔(26.12±0.57)ng/ml，P＜0.01〕，MCG 與 CCNCG 無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 兩個基因位點基因型分布和等位基因頻率比較 基因位點rs61330082的基因型頻率及等位基因頻率分布有顯著性差異(P＜0.01)而rs2058539的基因頻率及等位基因頻率分布無顯著性差異(P＞0.05);位點rs61330082的T等位基因突變頻率顯示，T等位基因在CCNCG，MCG及MSCG是逐漸降低的趨勢。見表2，表3。

圖5 visfatin基因rs61330082位點CC型

表1 一般臨床資料比較(±s)

表1 一般臨床資料比較(±s)

一般臨床資料CCNCG MCG MSCG性別(男/女) 68(40/28) 66(40/26) 72(45/27)年齡(歲) 64.73±9.98 60.78±9.31 65.98±12.87 FBG(mmol/L) 5.62±3.28 5.78±6.34 5.68±7.08 LDL-C(mmol/L) 2.76±0.78 2.96±1.37 2.56±0.98 HDL-C(mmol/L) 1.07±0.54 1.10±0.36 0.97±0.85 TG(mmol/L) 1.17±0.45 1.92±0.83 1.97±0.97 C-反應蛋白(mg/L) 5.62±3.28 5.78±6.34 5.68±7.08尿素氮(mmol/L)5.26±1.78 6.25±0.1.83 6.29±2.32

表2 兩個基因位點基因頻率的比較〔n(%)〕

表3 兩個基因位點等位基因頻率的比較〔n(%)〕

2.4 Hardy-Weinberg平衡檢驗 本實驗人群的基因型分布與H-W平衡的理論相符合，樣本具有群體代表性。

3 討論

visfatin是一種在內臟脂肪組織中的高度表達的細胞因子，具有煙酰胺磷酸酶糖轉移酶的活性(NAMPT)，因其作為從骨髓基質細胞中激活的淋巴細胞分泌的蛋白而被人們所認識，其染色體位于7q22.1和7q31.33之間，長37.4 kb，由10個內含子和11個外顯子構成〔6〕。visfatin結構呈結晶狀，可受激素類、噻唑烷二酮類藥物的調節。visfatin對機體的急性效應包括保護缺血再灌注損傷的心肌，發揮類胰島素降低血糖水平的作用;慢性效應為促內皮細胞激活，介導炎癥反應，抗凋亡等作用。Chang等〔7〕研究證實visfatin通過NF-KB和PI3K途徑有促進血管新生的作用。還有證據表明〔8〕，經冠狀動脈造影證實的急慢性冠狀動脈疾病中，visfatin水平較健康對照組明顯升高，是獨立于其他冠心病的危險因素。Garten等〔9〕發現，visfatin水平與低密度脂蛋白呈正相關，與甘油三酯呈負相關，在肥胖的代謝綜合征患者中，與空腹血糖和甘油三酯呈正相關，與低密度脂蛋白呈負相關〔10〕。Berndt等〔11〕報道visfatin基因啟動子的-4689G/T基因多型性對血脂、肥胖和胰島素抵抗水平有影響。在純合子TT基因型中血清visfatin濃度高低與肥胖程度，體重指數，空腹胰島素相關，而在GG基因型中，只與空腹胰島素相關。

以上研究均為visfatin在各系統中發揮的作用。目前國內外文獻關于visfatin濃度與CHD相關性的研究頗多，但對visfatin的基因多態性研究甚少，尤其是與CAC的相關性研究更是少見。現在CAC被用于CHD風險的評估已被越來越多的專家所認可，認為CAC的進展可加重粥樣斑塊的形成，還與CHD患者的不良愈后有著必然聯系〔12〕。CAC不僅與CHD診斷密切相關，而且CAC嚴重程度與冠狀動脈狹窄程度有較高的相關性。本實驗說明血清visfatin濃度在MSCG患者中是發揮一定作用的，visfatin濃度越高，冠狀動脈越發生嚴重鈣化，visfatin水平高低與CAC程度呈正相關。位點rs2058539SNP雖存在遺傳突變，但是與CAC發展可能沒有相互關聯性。

冠心病的發病機制復雜，近年來的分子生物學研究CHD的發病機制與基因多態性相關，例如Apo-I，ACEI基因多態性等〔13〕，相關實驗均證實都與CHD的發病機制相關。本研究揭示了中國山東漢族人群中冠狀動脈鈣化的發病與血清visfatin及其基因位點rs61330058及rs2058539多態性相關情況。CAC患者血清visfatin濃度升高，能在一定程度上反應血管內皮功能破壞情況和CAC的嚴重程度，提示血清visfatin水平與CAC發展密切相關。而基因研究提示visfatin rs61330058 SNP的T等位基因突變多態性與CAC的相關性，證實T基因具有保護心血管的作用，即存在基因突變后T基因的人群，其患CAC的概率就降低。目前診斷冠心病的“金標準”仍然是冠狀動脈造影，此診斷方法造價高，患者住院時間長，并且為有創性檢查，病人一般難以接受。本實驗的臨床意義即通過血清visfatin濃度和基因型的檢測可以篩查CHD的高危人群，為冠心病患者動脈硬化程度的預測及開發新的藥物提供理論基礎，有助于早期發現和防治CHD。本實驗還有一些不足之處，只做了2個基因位點的研究，其中位點rs2058539并沒有做出與CAC發生發展的相關性，考慮是否與樣本量小有關系。如果要揭示多個基因位點與冠心病之間的關系，還需要擴大樣本量，進行綜合性的研究。

1 Goldstein BJ，Scalia R.Adiponectin:a novel adipokine linking adipocytes and vascular function〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2004;89(6):2563-8.

2 Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M，et al.Visfatin:a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin〔J〕.Science，2005;307(5708):426-30.

3 Tarride JE，Lim M，DesMeules M，et al.A review of the cost of cardiovascular disease〔J〕.Can J Cardiol，2009;25(6):e195-202.

4 Bulcao C，Ferreira SR，Giuffrida FM，et al.The new adipose tissue and adipocytokines〔J〕.Curr Diabetes Rev，2006;2(1):19-28.

5 Gulati GS，Seth S，Kurian S，et al.Non-invasive diagnosis of coronary artery disease with 16-slice computed tomography〔J〕.Natl Med J India，2005;18(5):236-41.

6 De Carvalho MH，Colaco AL，Fortes ZB.Cytokines，endothelial dysfunction，and insulin resistance〔J〕.Arq Bras Endocrinol Metabol，2006;50(2):304-12.

7 Chang Y，Chang T，Lee W，et al.The relationship of visfatin/pre-B-cell colony-enhancing factor/nicotinamide phosphoribosyltransferase in adipose tissue with inflammation，insulin resistance，and plasma lipids〔J〕.Metab Clin Exp，2010;59(1):93-7.

8 Lu LF，Yang SS，Wang CP，et al.Elevated visfatin/pre-B-cell colony-enhancing factor plasma concentration in ischemic stroke〔J〕.J Stroke Cerebrovasc Dis，2009;18(5):354-9.

9 Garten A，Petzold S，Barnikol-Oettler A，et al.Nicotinamide phosphoribosyltransferase(NAMPT/PBEF/visfatin)is constitutively released from human hepatocytes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2010;391(1):376-81.

10 Costford SR，Bajpeyi S，Pasarica M.Skeletal muscle NAMPT is induced by exercise in humans〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2010;98:E117-26.

11 Berndt J，Kloting N，Kralisch S，et al.Plasma visfatin concentrations and fat depot-specific mRNA expression in humans〔J〕.Diabetes，2005;54(10):2911-6.

12 陳灝珠.實用內科學〔M〕.第12版.北京:人民衛生出版社，2005:1460.

13 Raggi P，Cooil B，Shaw LJ，et al.Progression of coronary calcification on serial electron beam tomography scanning is greater in patients with future myocardial infarction〔J〕.Am J Cardiol，2003;92:827-9.