LY-294002對大鼠急性脊髓損傷后Bcl-2表達的影響

王巖峰 秦光華 楊明超 王 喆 (中國醫科大學附屬第一醫院骨科，遼寧 沈陽 110001)

Bcl-2抑制細胞凋亡基因機制為:①抑制內質網Ca2+的釋放;②Bcl-2阻止促凋亡基因信號傳遞或阻止誘導某些基因表達;③抑制自由基。潘磊等〔1〕對60只Wistar成年大鼠研究發現，實驗組Bcl-2蛋白不僅在神經元中提高表達，更多在膠質細胞中表達，同時降低Bax的表達，BBB評分表明，神經細胞凋亡明顯減少，大鼠神經功能恢復明顯。國外有學者證實毫微粒MP療法能減少副作用，增強急性脊髓損傷(SCI)功能恢復，其機制之一仍為提高 Bcl-2表達和抑制 Bax表達〔2〕，但是 LY-294002是否能夠提高SCI大鼠脊髓損傷部位Bcl-2的表達尚不清楚。本實驗參照Nystrom壓迫方法制作大鼠脊髓壓迫損傷模型，通過免疫組化和Western印跡方法檢測不同時間點Bcl-2的表達情況，探討PI3K/Akt信號通路在SCI的病理作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 羊抗大鼠Bcl-2多克隆抗體(Santa-Cruz，CA);PI3K阻斷劑(LY-294002)，兔抗羊IgG、S-P免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(福州邁新)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SCI動物模型的建立及分組 取健康成熟SD大鼠104只，雌雄不限，體重220～250 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。隨機分為:SCI組:脊髓損傷后分2 h，8 h，1 d，3 d，5 d，7 d共個6時間點，每個時間點8只;LY294002組:脊髓損傷前 0.5 h 尾靜脈注射 LY-294002，分為 2 h，8 h，1 d，3 d，5 d，7 d共6個時間點，每個時間點8只，空白對照組8只，不做任何處理。模型制備:10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔內注射，俯臥位固定，無菌原則下進行背正中切口，切除T8、T9椎板，暴露硬脊膜，整個過程保證硬脊膜的完整。按Nystrom法將35 g重物通過2.2 mm×5 mm弧形光滑金屬墊片壓迫該段脊髓后正中部5 min，分層縫合，碘伏消毒。損傷后，每天人工排尿(便)兩次，局部消毒一次。

1.2.2 取材及切片制備 各組大鼠分別于脊髓損傷后各時間點取材，麻醉后剖胸，經左心室-主動脈插管，4%多聚甲醛灌流固定。以傷處為中心取1.5 cm脊髓組織，多聚甲醛浸泡固定。常規蠟塊包埋，連續切片數張(縱切)，片厚6 μm。

1.2.3 免疫組化 每只大鼠取12張切片，按SP試劑盒說明書測定Bcl-2的表達，常規脫蠟至水，3%過氧化氫處理、高溫修復、血清封閉、滴加一抗過夜(濃度為1∶150)，并同時用PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜、隔日滴加二抗孵育20 min、SABC 37℃孵育20 min，繼而DAB顯色，鏡下觀察顯色背景。以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察脊髓組織變化。

1.2.4 Western印跡 動物以10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔內注射，麻醉后，各時間點分別取4只動物，直視下取出距損傷中心區上下各0.5 cm兩段脊髓，置于裂解液中機械勻漿，4℃ 17 000 r/min離心1 h，取上清，測蛋白濃度并計算加樣量。制備12%分離膠，4%濃縮膠，用微量加樣器將樣品加在凝膠表面樣品槽中。電泳后濕轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4℃過夜。一抗Bcl-2、β-actin(1∶200)室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標記羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000，Santa Cruz)室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑(Santa Cruz)反應1 min，暗室曝光顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統上攝像分析，測得目標帶的MOD，進而計算出各組樣品Bcl-2目標帶的MOD與內參照βactin MOD的比值。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件對數據進行統計分析，結果用±s表示，各組比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果 免疫組化結果發現，假手術組大鼠脊髓有大量的Bcl-2陽性表達的神經細胞(0.71±0.04);而在脊髓損傷后2 h時，Bcl-2陽性細胞數已開始明顯減少，在3 d時Bcl-2陽性表達細胞數最少，5 d時Bcl-2陽性表達細胞數開始增加。在經LY-294002處理后的各時間點大鼠脊髓損傷部位的Bcl-2陽性細胞明顯高于相同時間點的脊髓損傷組大鼠(P＜0.05)。顯微圖像分析統計光密度值是也得到了相同的結論，光密度值比較，見圖1，表1。

2.2 Western印跡結果 從Western印跡電泳結果上可以看出，假手術組大鼠脊髓部位的Bcl-2的蛋白條帶清晰(0.54±0.04)，而在脊髓損傷后2 h的Bcl-2的蛋白條帶顏色已開始變淺變細，表達量開始減少，到3 d時，蛋白表達的條帶最淺，5 d時表達開始逐漸增多，在經LY-294002處理后的各時間點大鼠脊髓損傷部位的Bcl-2蛋白表達則明顯高于相同時間點的脊髓損傷組大鼠(P＜0.05)，見圖2，表2。

表1 各組大鼠的Bcl-2蛋白的光密度值比較(± s，n=8)

表1 各組大鼠的Bcl-2蛋白的光密度值比較(± s，n=8)

與SCI組比較:1)P＜0.05，下表同

組別2 h 8 h 24 h 3 d 5 d 7 d SCI組 0.58±0.06 0.51±0.07 0.46±0.07 0.32±0.06 0.41±0.06 0.55±0.07 LY294002組 0.64±0.071) 0.56±0.071) 0.50±0.061) 0.42±0.061) 0.48±0.071) 0.61±0.071)

表2 各組大鼠的Bcl-2/β-actin的光密度值比較(± s，n=8)

表2 各組大鼠的Bcl-2/β-actin的光密度值比較(± s，n=8)

組別2 h 8 h 24 h 3 d 5 d 7 d SCI組 0.43±0.04 0.41±0.05 0.38±0.04 0.31±0.04 0.34±0.04 0.40±0.02 LY294002組 0.49±0.051) 0.46±0.041) 0.42±0.021) 0.40±0.021) 0.42±0.021) 0.43±0.021)

圖1 免疫組化方法檢測Bcl-2蛋白的表達(×400)

圖2 Western印跡方法檢測Bcl-2和β-actin蛋白的表達

3 討論

SCI為臨床常見的嚴重創傷，因高致殘率和高病死率一直成為醫學研究的熱點。SCI包括原發性損傷和繼發性損傷，原發性損傷不可逆，無法對其進行有效的治療。繼發性損傷是指傷后幾小時至幾天脊髓損傷局部原來正常的組織發生自身破壞性病變，其造成的損害超過原發性損傷〔3～5〕，研究證實，脊髓繼發性損傷廣泛存在著細胞凋亡現象〔6〕。

細胞凋亡受多種凋亡相關基因及其蛋白的調控，其中Bcl-2基因家族及其相關蛋白在細胞凋亡的調控過程中具有重要作用〔7〕，Bcl-2主要位于線粒體外膜、核被膜和內質網膜，可抑制細胞凋亡基因，有研究證實，β-七葉皂甙鈉改善血循環，中止SCI繼發性損傷，抑制脊髓神經細胞凋亡和炎癥表達的機制之一是上調Bcl-2表達〔8〕，還有研究發現，銀杏葉提取物(EGb)能抑制SCI后細胞凋亡，在運動功能恢復、損傷脊髓組織保護上發揮其有益作用，其機制之一也是上調Bcl-2和下調Bax基因表達〔9，10〕。磷脂酰肌醇(-3)激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信號通路是體內非常重要的一個信號通路，能夠調節細胞凋亡、葡萄糖代謝及蛋白質合成等過程。LY-294002是PI3K的特異性抑制劑，能夠抑制PI3K的表達，阻斷PI3K/Akt信號傳導通路。但是，LY-294002是否能夠通過阻斷PI3K/Akt信號傳導通路繼而降低Bcl-2的表達參與脊髓損傷尚不清楚，這也是本實驗研究的目的。本研究說明LY294002能夠通過阻斷PI3K/Akt信號傳導通路繼而降低Bcl-2的表達。

1 潘 磊，呂國華，雷 高，等.大劑量甲基強的松龍對大鼠脊髓損傷后神經細胞凋亡的影響〔J〕.鄖陽醫學院學報，2007;26(5):271-4.

2 Kim YT，Caldwell JM，Bellamkonda RV.Nanoparticle mediated local delivery of methylprednisolone after spinal cord injury〔J〕.Biomaterials，2009;30(13):2582-90.

3 Calvillo L，Latini R，Kajstura J，et al.Recombinant human erythropoietin protects the myocardium from ischemia reperfusion injury and promotes beneficial remodeling〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100:4802-6.

4 霍 巖，沈兆亮，王 冬，等.重組人促紅細胞生成素對大鼠脊髓損傷后VEGF表達的影響〔J〕.解剖科學進展，2012;18(1):109-12.

5 霍 巖，沈兆亮，王 冬，等.重組人促紅細胞生成素對大鼠脊髓損傷后NFκB表達的影響〔J〕.解剖科學進展，2012;18(2):70-3.

6 Bardeesy N，de Pinho RA.Pancreatic cancer biology and genetics〔J〕.Nat Rev Cancer，2002;12:897-909.

7 Rami A，Bechmann I，Stehle JH.Exploiting endogenous anti-apoptotic proteins for novel therapeutic strategies in cerebral ischemia〔J〕.Prog Neurobiol，2008;85(3):273-96.

8 王金光，鄭啟新，郭曉東，等.應用β-七葉皂甙鈉治療大鼠脊髓損傷的實驗研究〔J〕.中國康復醫學雜志，2005;2(1):15-7，80.

9 Ao Q，Sun XH，Wang AJ，et al.Protective effects of extract of Ginkgo biloba(EGb 761)on nerve cells after spinal cord injury in rats〔J〕.Spinal Cord，2006;44(11):662-7.

10 張 烽，馮煒煒，周海濤.銀杏葉提取物對大鼠急性脊髓損傷后神經功能恢復的作用及其機制〔J〕.中國脊柱脊髓雜志，2007;17(9):675-9.