缺氧誘導因子-1α及血管內皮生長因子在Ⅱ型膠原誘導性關節炎模型中的致病作用

劉 菁 梁 爽 黃大林 王 雯 李莎莎 陳森洲 (桂林醫學院，廣西 桂林 541004)

類風濕關節炎(RA)不僅累及關節，而且具有嚴重的并發癥及多種關節外表現，其病因和發病機制迄今尚未明確。近年來研究發現，低氧誘導因子-1α(HIF-1α)在調節缺氧組織血管新生、細胞增殖存活、能量代謝、鐵轉運等方面具有重要作用。血管內皮生長因子(VEGF)可直接促進滑膜血管翳形成、加重滑膜炎癥及骨與關節軟骨的破壞。Tang等〔1〕通過對腫瘤內皮細胞敲除HIF-1α基因，證實了HIF-1α調控血管發生的功能。HIF-1α通過上調VEGF表達，促進血管生成，可能是其參與RA發病最重要機制之一。本文探討HIF-1α在RA發病過程中的作用及其與VEGF之間的關系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 病理組織切片機(LEICA RM，2025，德國);制冰機(SLM-F124，日本);多功能高速冷凍離心機(Eppendorf，5804R，德國);生物組織自動脫水機(TS-12F，湖北)及病理組織包埋機和包埋冷凍臺(BMJ-III，常州)等。

1.2 主要試劑 牛Ⅱ型膠原，不完全弗氏佐劑(Sigma，F5506-10 ml)，TRIZOL(美國 Invitrogen 公司，批號 1382739)，RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司，DRR014A)，HIF-1α一抗(Abcam，批號653496)，二抗、DAB顯色劑(福州邁新生物工程有限公司，批號:100301408A、1003150031)，羊血清工作液(北京中衫金橋生物工程有限公司，批號:90519050)。

1.3 實驗動物及分組 選用體重150～180 g的50只SD健康大鼠(雌雄各半)，動物級別:SPF，由本院實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK桂2007-0001，購入本實驗室動物房分籠喂養，每籠5只。每日給予標準飼料，清潔自來水置籠側自由飲用，適應性飼養1 w后進行實驗。

1.4 模型制作〔2〕Ⅱ型膠原用0.1 mol/L冰醋酸溶解后，配成2 g/L溶液，置4℃冰箱過夜。第2天將攪拌好的Ⅱ型膠原醋酸溶液按1∶1在冰浴中滴加至 IFA，充分乳化后，終濃度為1 g/L。大鼠麻醉后，背部剃毛，在尾根部、背部分4～5點皮內注射乳化液0.5 ml，正常對照組(A組)同法同部位注射0.5 ml生理鹽水，7 d后同法同部位(避開原注射部位)半量加強免疫一次。

1.5 病理標本制作 造模組B、C、D、E組大鼠分別于初次免疫后第21、28、35、42天處死，正常對照組大鼠于注射生理鹽水后第42天處死，進行指標檢測，取材部位為踝關節。將修剪后關節至4%多聚甲醛中固定12 h后，放入10%EDTA(pH7.0)中脫鈣，脫鈣液與標本體積保持＞10∶1比例。將脫鈣液和標本放入46℃水浴箱中，隔天換一次脫鈣液，用大頭針刺扎標本，直到針頭可刺入骨密質為止，脫鈣時間大約2～3 w〔3〕。脫鈣完畢后，將標本脫水透明石蠟包埋，連續切片，片厚3 μm，分別行HE染色，SP免疫組織化學染色法檢測HIF-1α蛋白的表達。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠一般狀況及體重測定 造模前后動態觀察大鼠體重、毛發色澤改變、神志、活動狀態，食量變化及關節紅腫情況，每周定期測量每只大鼠體重。

1.6.2 關節炎指數〔3〕(AI) 根據大鼠踝關節、跖趾關節、趾關節紅腫程度及受影響關節數進行評分。0分:正常;1分:1個關節紅腫;2分:2個及2個以上關節紅腫;3分:踝關節以下足掌嚴重紅腫;4分:包括踝關節在內的全部足爪紅腫且不能負重。四肢分別評分，累計總和即為AI。AI＞5分為造模成功。

1.6.3 踝關節影像學觀察 初次免疫后第21天、第42天經1%戊巴比妥麻醉大鼠后，拍攝踝關節X線片。攝片條件為40 kV。

1.6.4 滑膜病理學評分〔4〕滑膜細胞增生、滑膜下層炎癥程度及血管生成情況?；ぜ毎錾u分:少于3層為0分，3～4層為1分，5～6層為2分，6層以上為3分。炎癥程度評分:無淋巴細胞浸潤為0分，淋巴細胞聚集為1分，彌漫分布形成淋巴濾泡形成為2分，形成淋巴濾泡淋巴濾泡伴生發中心或生發中心為3分。血管生成評分:無新生血管生成為0分，輕度新生血管生成為1分，中度為2分，重度為3分。以上3項評分累計總和即為病理學總評分。

1.6.5 免疫組織化學染色結果判定及評分 采用半定量記分法判定:①按陽性著色程度評分。0分為無著色，與背景色一致;1分為淺黃色，略高于背堪色;2分為棕黃色，明顯高于背景色;3分為棕褐色。②按陽性細胞所占比例評分。0分為陰性;1分為10%以下;2分為11% ～50%;3分為51% ～75%;4分為75%以上。③兩者乘積判定陽性結果。HIF-1α陽性細胞為胞漿或胞核呈棕黃色或棕褐色。

1.7 統計學處理 全部數據采用SPSS13.0統計軟件進行處理，正態分布資料用±s表示;多組間均數的比較采用單因素方差分析;半定量資料兩組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗;對兩組數據間的相關性進行Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 建立CIA大鼠模型 模型組50只大鼠在首次給藥后第12天起，有26只出現踝、跖趾關節以及趾關節紅腫。正常對照組未出現明顯關節紅腫。造模成功率為65%(26/40)。

2.2 一般情況 造模期間動物無死亡，對照組大鼠隨著飼養時間的延長，體重逐漸增加、精神狀態良好、毛發光澤、活動自如。模型組給藥12 d后開始出現不同程度后足爪紅腫、皮溫升高、毛發失去光澤、豎毛、脫毛、懶動、扎堆、精神怠倦、體重增長減慢甚至下降、飲食飲水量下降。給藥48 h后注射部位出現多個炎性小潰瘍，紅腫明顯，逐漸加重并破潰，7～10 d破潰處形成硬痂，而后脫落潰瘍愈合。模型組體重增長明顯小于對照組大鼠。

2.3 CIA大鼠AI及關節腫脹度的變化 隨著炎癥的發展，AI值逐漸增加。初次免疫12 d及以后各時間點AI值均與正常組比較有差異(P＜0.05)，第21天達峰值，之后逐漸下降，42 d降至最低值，但仍高于正常組。正常對照組AI值均小于1(圖1)。模型組大鼠初次免疫后第7天部分大鼠足趾表面發紅，皮溫升高，第12天開始相繼出現后足爪明顯腫脹，關節僵硬，活動受限，第21天達高峰，隨后關節腫脹有所減輕，持續至第42天。正常對照組均未見明顯腫脹。AI值與關節腫脹度均提示關節病變從第21天開始，持續至第42天，且21～28 d關節病變最明顯。

2.4 X線改變 對照組大鼠踝關節軟組織無腫脹，骨質無破壞，結構完整，足趾關節間隙清楚。CIA大鼠免疫后第21天，X線顯示踝關節周圍軟組織腫脹，足趾關節間隙模糊、狹窄及融合等表現。第42天踝關節骨骼結構排列紊亂，關節間隙不清，除見囊性骨吸收和骨侵蝕、骨質疏松和新骨形成外，伴有關節僵直，提示CIA模型大鼠發生慢性侵蝕性關節炎。

2.5 大鼠踝關節病理學變化 正常大鼠滑膜由1～3層扁平滑膜細胞組成，無炎細胞浸潤及血管增生，關節結構完整，軟骨層較厚，表面光滑。CIA組大鼠初次免疫后21 d時滑膜細胞層增至10～15層，增生滑膜形成血管翳，炎細胞浸潤;42 d侵蝕軟骨及骨，關節軟骨可見壞死脫落、纖維化，新生骨形成，關節腔狹窄，廣泛炎細胞浸潤，伴有不同程度軟組織水腫，滑膜下層大量纖維增生及新生血管形成，呈腫瘤性侵襲生長。見表1。

2.6 CIA大鼠滑膜HIF-1α的表達 正常對照組均未見HIF-1α(0.20±0.42)。CIA 模型組 B、C、D、E 組大鼠滑膜 HIF-1α表達增強(8.00±0.76、7.40±1.67、6.00±0.82、5.00±1.26，P＜0.01)，HIF-1α在細胞核及細胞質中均表達。從免疫組化結果可以看出不僅滑膜細胞，滑膜下層巨噬細胞、部分血管內皮細胞、成纖維細胞等也表達HIF-1α。在第21、28天滑膜細胞陽性表達量及程度最高，隨病程進展，陽性表達量及程度逐漸下降。見圖2。

圖1 大鼠AI平均積分

表1 各組大鼠滑膜病理學評分(±s)

表1 各組大鼠滑膜病理學評分(±s)

與A組比較:1)P＜0.01;與B組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 總分 滑膜增生 炎癥 血管生成A(n=10)0.30±0.48 0.20±0.42 0.10±0.32 0.20±0.42 B(n=8) 6.25±1.281)2.38±0.74 1.38±0.74 2.50±0.53 C(n=5) 5.80±0.841)2.00±0.71 1.40±0.55 2.40±0.55 D(n=7) 5.14±1.351)1.43±0.532)1.86±0.69 1.86±0.69 E(n=6) 4.50±0.841)1.33±0.52 1.67±0.88 1.50±0.553)

圖2 模型組關節滑膜組織HIF-1α表達(DAB，×400)

2.7 CIA大鼠滑膜HIF-1α表達與AI的關系 HIF-1α表達情況分別與大鼠AI進行相關回歸分析，均呈明顯正相關(r值為0.73，P＜0.05)。

2.8 CIA大鼠HIF-1α表達與病理學評分的關系 CIA大鼠各組HIF-1α蛋白表達的免疫組化評分與各組滑膜病理學總評分、滑膜增生評分及血管生成評分均呈明顯正相關(r值分別為0.40、0.48及0.50，P＜0.05)，與炎癥浸潤評分無明顯相關(r值為0.30，P＞0.05)。

3 討論

CIA是目前用于研究RA的最佳模型，通過使用尾跟部皮內注射天然Ⅱ型膠原免疫SD大鼠，成功構建了CIA模型。RA主要病理改變為滑膜炎，滑膜細胞增殖具有錨著非依賴性生長、失去接觸抑制、凋亡減少及侵蝕性等類似腫瘤生長〔5〕的特點?；ぜ毎@種類腫瘤樣增殖和大量炎癥細胞的浸潤，導致局部毛細血管氧彌散距離及耗氧量的增加，進而造成一個低氧微環境。本實驗發現，CIA大鼠滑膜表達HIF-1α明顯增強，造模后第21～28天模型組關節腫脹程度最顯著，此時HIF-1α表達也比其他時間點明顯升高，隨著發病時間延長，表達量逐漸下降，HIF-1α在CIA大鼠關節病變過程中呈動態表達。且HIF-1α表達與關節炎活動指標及滑膜病理學總評分呈明顯正相關，提示HIF-1α與VEGF在RA滑膜組織增生和血管生成中起重要作用〔6〕。

實驗研究結果顯示CIA大鼠關節滑膜表達HIF-1α，并與關節炎病情活動、滑膜增生及血管生成密切相關，提示HIF-1α很可能在RA中通過調控一系列下游靶基因，影響滑膜炎的發生、發展。由于RA是“難治之癥”，因此，探究HIF-1α在RA的發病機制中所發揮關鍵作用，很可能是重要的治療靶點?？赏ㄟ^對HIF-1α進行阻斷，從而阻止滑膜炎的發生、發展，基于抗HIF-1α的靶向治療有望對RA治療提供科學的理論依據和可行的方法指導，從而為RA的治療開辟新途徑。

1 Tang N，Wang L，Esko J，et al.Loss of HIF-1alpha in endothelial cells disrupts a hypoxia-driven VEGF autocrine loop necessary for tumorigenesis〔J〕.Cancer Cell，2004;6(5):485-95.

2 Baharav E，Mor F，Halpern M，et al.Lactobacillus GG bacteria ameliorate arthritis in Lewis rats〔J〕.J Nutr，2004;134(8):1964-9.

3 Tsubaki T，Arita N，Kawakami T，et al.Characterization of histopathology and gene-expression profiles of synovitis in early rheumatoid arthritis using targeted biopsy specimens〔J〕.Arthritis Res Ther，2005;7(4):825-36.

4 王 雯，陳森洲，王險鋒，等.HIF-1α、VEGF在CIA模型中的表達與意義〔J〕.第三軍醫大學學報，2010;32(6):563-7.

5 Rudolph EH，Woods JM.Chemokine expression and regulation of angiogenesis in rheumatoid arthritis〔J〕.Curr Pharm Des，2005;11(5):613-31.

6 陳森洲，王險峰，侯巧燕，等.低氧誘導因子-1α在CIA模型中的表達及其意義〔J〕.中華微生物學和免疫學雜志，2010;30(2):115-9.