老年大鼠海馬細胞凋亡和神經元信號轉導通路的變化與學習記憶的關系

王 暖 耿德勤 黃紅莉 周 昊 楊秀華 (徐州市第一人民醫院神經內科，江蘇 徐州 22002)

衰老與海馬細胞凋亡以及神經元存活信號轉導通路的變化有著密切聯系，但眾說不一。磷脂酰肌醇3-激酶 (PI3K)-AKt-Caspase-9信號轉導途徑是細胞內重要的信號轉導通路，在細胞的凋亡、存活、增殖以及細胞骨架的變化等活動中發揮重要的生物學功能，其中尤為重要的是它對細胞凋亡、存活的調節作用〔1，2〕。而老年大鼠是否存在 PI3K-AKt-Caspase-9信號轉導通路的障礙，尚不十分清楚。本研究探討老年大鼠海馬組織細胞凋亡、PI3K-AKt-Caspase-9信號轉導通路與學習記憶的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑和儀器 健康SD大鼠:青年鼠(8月齡，200～250 g)，老年鼠(24月齡，450～500 g)各8只，雌雄各半，由徐州醫學院實驗動物中心提供。Caspase-9 P35抗體、PI3K P85抗體、AKt抗體、p-AKt(ser473)抗體及二抗均購自美國Santa Cruz公司，p(Tyr)-PI3K P85抗體購自美國cell signaling公司，Y型迷宮、免疫組化試劑盒和TUNEL試劑盒均購自國內。

1.2 學習記憶能力測試 兩組大鼠分別進行Y型迷宮實驗。連續10次電擊中有9次正確為達到學會標準，記錄動物達到標準所需電擊的次數，以此作為學習快慢程度的指標，24 h后重復以上實驗過程，觀察大鼠的記憶能力。

1.3 TUNEL染色和免疫組化染色 Y迷宮測試24 h后留取8只(每組4只)大鼠麻醉，仰臥于固定臺上，暴露心臟，經左心室插入導管至升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水100～150 ml，再灌注4℃4%多聚甲醛300 ml，然后斷頭取腦，在視交叉后1 mm及4 mm處以冠狀切面切開鼠腦留取中間切塊，入4%多聚甲醛中后固定24～48 h，然后按以下程序進行:固定后組織塊經流水沖洗1～1.5 h，80%、95%、100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，每一組織塊作5 μm的連續切片，貼于載玻片，60℃ ～70℃烤片6 h以上以備TUNEL法染色和免疫組化染色。染色方法按試劑盒說明書進行。在400倍鏡下左側海馬區隨機取5個不重疊的視野進行TUNEL、p-PI3K P85、p-AKt和Caspase-9 P35陽性神經元計數(個/視野)，結果取5個視野的平均值。

1.4 Western印跡 余8只大鼠冰浴上斷頭取腦，剝離雙側海馬進行組織勻漿;離心15 min;取上清用lowary法測蛋白含量;分裝，－20℃凍存備用;取30 μl蛋白在SDS-PAGE膠中電泳;之后將蛋白質轉至NC膜;取出膜后用BSA封閉室溫下振搖3 h，以阻斷非特異性結合;再分別加入1∶200稀釋的一抗(p-PI3K P85、P-AKt、PI3K P85、AKt、Caspase-9 P35)4℃ 孵育過夜;反應完后二抗溫育2 h，AP顯色系統顯色。

2 結果

2.1 大鼠學習及記憶能力比較 與青年大鼠相比，老年大鼠學習嘗試次數明顯增加，記憶正確次數明顯減少，差異均有極顯著性(P＜0.01)。見表1。

表1 兩組大鼠學習及記憶能力比較(± s，n=8)

與青年組比較:1)P＜0.01

組別 學習嘗試次數(次) 記憶正確次數(次)青年組50.0±6.3 7.7±0.5老年組 75.0±5.51) 4.0±0.91)

2.2 大鼠海馬區TUNEL陽性神經元數比較 青年大鼠海馬區未見TUNEL陽性神經元。老年大鼠可見到較多TUNEL陽性神經元(36.3±1.1)，其細胞核固縮深染，呈現棕黃色，與青年組相比，差異有極顯著性(P＜0.01)。見圖1。

2.3 免疫組化染色結果 青年組海馬區可見較多p-PI3K、p-AKt陽性表達細胞，其染色深，胞漿著色呈棕黃色。老年組海馬區陽性表達細胞明顯減少，與青年組相比，差異有極顯著性(P＜0.01)。青年組海馬區偶見Caspase-9P35陽性神經元。老年組海馬區可見較多Caspase-9P35陽性表達細胞，其染色深，棕黃色顆粒主要沉積在胞核周圍，與青年組相比，差異有極顯著性(P＜0.01)。見表2，圖2～圖4。

圖2 大鼠海馬P-PI3表達(DAB，×400)

圖3 大鼠海馬p-AKt表達(DAB，×400)

圖4 大鼠海馬Caspase-9P35表達(DAB，×400)

表2 兩組大鼠海馬區p-PI3K、p-AKt、Caspase-9p35陽性神經元數比較(±s，n=4，個/視野)

表2 兩組大鼠海馬區p-PI3K、p-AKt、Caspase-9p35陽性神經元數比較(±s，n=4，個/視野)

與青年組比較:1)P＜0.01

組別p-PI3K陽性神經元p-AKt陽性神經元Caspase-9p35陽性神經元青年組36.0±2.6 24.0±2.9 7.0±1.8老年組 9.4±2.01) 8.7±1.11) 25.5±2.41)

2.4 Western印跡結果 與青年組相比，老年組海馬區p-PI3K、p-AKt的活性明顯降低，Caspase-9p35蛋白表達明顯增加(P＜0.01);PI3K、AKt蛋白表達在兩組之間變化無統計學意義。見圖5。

圖5 兩組大鼠海馬組織p-PI3K、PI3K、p-AKt、AKt及Caspase-9p35蛋白表達

3 討論

近年來在細胞生物學和分子生物學迅速發展的推動下衰老機理的研究已取得了重大進展，其中最具有代表性的學說有:自由基學說、線粒體DNA損傷學說、端粒學說和基因學說〔3，4〕。大量資料顯示，衰老大鼠不但出現基底前腦膽堿能神經元的丟失、海馬的膽堿能纖維減少和膽堿乙酰轉移酶(ChAT)活性下降，而且出現學習記憶障礙。在本研究中，使用Y型電迷宮評價了老年鼠的學習記憶功能，表現為學習嘗試次數明顯增多，記憶正確次數明顯減少，結果表明老年大鼠發生了嚴重的學習記憶障礙。

有證據表明，在老化過程中存在著神經細胞的凋亡，表現為一些部位神經細胞的減少、細胞對外界刺激不可修復的生物學反應和細胞不能夠對生存信號起反應最終導致死亡的一種生物學過程〔5〕等。衰老機體生長因子合成降低、跨膜信號缺陷、控制細胞增殖的特殊基因表達缺陷，不能對付氧化應激，使得衰老機體易于激發凋亡過程〔6〕。在中樞神經系統中，神經生長因子(NGF)等因子與其相應受體結合〔7〕，啟動PI3K信號轉導途徑，通過PI3K-Akt-caspase-9通路，使神經元存活并維持正常功能。PI3K/AKt通路是一個公認的細胞存活通路，介導多種生長因子的生物學效應，如促細胞存活、誘導細胞分化和促細胞生長等〔8～10〕，是抗凋亡、促進細胞增殖的重要信號途徑〔11，12〕。caspase-9 是活化的 AKt主要下游靶蛋白，完整的caspase-9即procaspase-9為46 000多肽是沒有活性的前蛋白，激活后裂解為37000或35000的活性片段〔13〕。本實驗檢測的就是有活性的片段caspase-9 p35。Perianayagam等〔14〕注意到，C5a處理的中性粒細胞中caspase-9活性在加入PI3K抑制物Wortmannin后顯著提高。當各種原因引起神經存活因子減少或損傷性因素增加時，對信號傳導通路的刺激減弱，使多種維持神經元存活的重要蛋白不能隨之激活，由此引起神經元功能減退和細胞凋亡進而影響大鼠的認知功能〔15〕。本實驗結果說明老年大鼠海馬神經元存在著PI3K-Akt-caspase-9信號轉導通路的障礙，可能是導致老年大鼠海馬神經細胞凋亡、學習記憶功能衰退的重要機制。

總之，老年鼠在衰老過程中，由于PI3K-Akt-caspase-9信號轉導通路的障礙，導致海馬神經元凋亡，由于海馬是動物學習、記憶的重要神經解剖學結構〔16〕，故導致學習記憶能力下降。

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