人羊膜間充質干細胞靜脈移植后在心肌梗死大鼠體內的定植及分化

王鈺瑩 方 寧 陳代雄 余麗梅 劉祖林 萬 雪

(遵義醫學院附屬醫院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563003)

成體干細胞(SSC)具有一定的發育潛能，在適當的條件下可分化成特化的組織細胞，而且來源較廣，可體外擴增，不牽涉倫理學問題，因而在再生醫學領域具有廣闊的應用前景。人羊膜間充質干細胞(hAD-MSCs)也是一類典型的SSC，它具有易于體外擴增，無免疫原性、多分化潛能等優點，可以成為細胞移植治療缺血性心肌病的一種有前途的新細胞來源〔1～4〕。移植途徑是影響細胞移植治療效果和安全性的重要因素，在動物實驗和臨床試驗中采用的細胞移植途徑包括心肌內注射、冠狀動脈內注射、冠狀靜脈竇移植等。而經靜脈內移植，由于可以反復、多次、大量進行無創的治療，是最具有應用前景的治療方法。本實驗旨在觀察靜脈移植hAD-MSCs到心肌梗死 (MI)大鼠體內后在重要臟器的分布以及對心功能的影響，探討靜脈移植hAD-MSCs治療MI的可行性和安全性。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，體重(200±20)g，購自第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心〔許可證號:SCXK(渝)2007-0005〕。LG-DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)、鼠抗人Brdu抗體、α-輔肌動蛋白抗體購自Sigma公司，連接蛋白-43(CX-43)抗體、羊抗鼠IgG-FITC、羊抗兔Ig-Texas Red購自Santa Cruz公司，鼠抗人細胞核特異性抗體MAB1281、結蛋白抗體購自Chemcion公司，免疫組化單染試劑盒(EnVisionTMDetection Systems Peroxidase/DAB，兔/鼠)購自Gene Tech公司，用于流式細胞儀檢測的全部熒光標記抗體均購自BD公司，彩色多普勒超聲心動圖儀為德國ACUSON公司產品(型號Sequoia512)。

1.2 hAD-MSCs分離、培養、鑒定及標記 經知情同意后，采自足月剖宮產分娩胎盤，剝離羊膜，D-Hank液反復沖洗，剪碎羊膜，0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶37℃消化20 min，反復3次，棄上清液，去除羊膜上皮細胞。0.75 mg/mlⅡ型膠原酶，0.075 mg/ml DNaseⅠ，37℃，200 r/min 旋轉消化 2 h，300 目不銹鋼網過濾，收集細胞濾液，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，細胞重新懸浮于含10%FBS的 L-DMEM培養基中，于37℃、5%CO2培養箱中孵育。細胞增殖達80%融合時細胞傳代，取第3代細胞用流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD44、CD73、CD90、CD 105、CD45、CD34、CD11b、CD19 及 HLA-DR 的表達，免疫細胞化學染色檢測波形蛋白。取第3代細胞以5×105/cm2細胞密度分別接種，接近50%融合時，加入Brdu(終濃度為10 μg/ml)，孵育48 h，收集Brdu標記的細胞供移植時使用。

1.3 大鼠MI模型的建立及hAD-MSCs移植〔5〕10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉，氣管插管，在心電監護下，左胸第2～3肋間隙開胸，于左心耳下方1～2 mm處用6/0號絲線結扎左冠狀動脈前降支，心電圖示R波振幅升高，ST段(J點)抬高可確定建模成功。術后腹腔注射青霉素20 IU/kg連續7 d。實驗設模型組、hAD-MSCs移植組和假手術組各12只。移植組經舌下靜脈注入 Brdu標記的 hAD-MSCs懸液0.4 ml(2×106個細胞/只)，模型組和假手術組分別經相同途徑注射等體積無血清培養基。

1.4 心臟功能檢測 分別于制模前，制模后1 w及移植后6 w采用彩色多普勒超聲心動圖儀(15 MHz探頭)檢測左室心功能，檢測時探頭置于大鼠胸前，調整角度取胸骨旁左室長軸和乳頭肌水平短軸切面。檢測指標包括射血分數(EF)、左室短軸縮短率(FS)、舒張期左室前壁厚度(LVAWd)、收縮期期左室前壁厚度(LVAWs)、左室舒張末期內徑(LVDd)、左室收縮末期內徑(LVDs)、左室舒張末期容積(EDV)和左室收縮末期容積(ESV)。每項指標連續測定3次，取平均值。

1.5 組織學、免疫組化和免疫熒光檢測 心功能測定結束后處死動物，取心、肝、肺和脾臟組織置于4%多聚甲醛中固定，20%蔗糖溶液脫水，石蠟包埋，按5μm厚度連續切片，脫蠟水化，心肌組織行HE染色。免疫組化染色:組織切片經脫蠟至水，阻斷內源性過氧化物酶，DNA變性，山羊血清封閉后，加鼠抗人Brdu單抗，4℃孵育過夜，加兔鼠通用二抗。DAB顯色，顯微鏡下觀察，細胞核呈棕褐色者為Brdu標記陽性細胞。免疫熒光染色:取心臟剝離左心室，經OCT包埋后連續切成5 μm超薄切片，室溫晾干，Triton X-100作用，山羊血清封閉后，加入小鼠抗人細胞核特異性抗體MAB1281與CX-43抗體或α-actinin抗體的混合抗體，4℃孵育過夜，加入FITC標記的羊抗鼠IgG與德克薩斯紅(TR)標記的羊抗兔IgG混合的二抗，37℃避光孵育2 h。甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 hAD-MSCs形態、表型特征及Brdu標記效果 hAD-MSCs形態為梭形或多角形，細胞排列緊密，胞體拉伸，呈單層放射狀或漩渦狀生長，增殖迅速。免疫組化染色顯示hAD-MSCs表達波形蛋白，增殖期hAD-MSCs的Brdu標記陽性率達90%以上(圖1)。FCM分析結果顯示，分離的hAD-MSCs高表達CD44、CD90、CD73 和 CD105，幾乎不表達 CD45、CD34、CD11b、CD19及 HLA-DR(圖2)。

圖1 hAD-MSCs生長形態及波形蛋白和Brdu標記細胞的免疫組化染色

圖2 hAD-MSCs流式細胞術表型分析結果

2.2 心肌組織病理變化 HE染色結果顯示，模型組MI區，可見心肌纖維腫脹，心肌細胞核消失，間質出血，心肌細胞壞死，伴大量急性炎癥細胞浸潤;hAD-MSCs移植組移植后6 w炎性細胞浸潤明顯減輕，新生毛細血管增多，形成瘢痕組織(圖3)。

2.3 hAD-MSCs經靜脈移植后在心、肝、肺和脾臟中的分布細胞移植后6 w的組織切片中可見Brdu標記的陽性細胞，主要分布于MI組織與正常組織的交界區域，細胞形態完整，細胞核呈棕褐色，而正常心肌組織未見陽性細胞。hAD-MSCs除可以分布在梗死心肌組織外，肺和脾臟組織中亦可見部分hADMSCs存活，但肝臟中未見hAD-MSCs。見圖4。

2.4 hAD-MSCs在MI大鼠心臟中的定植及分化 移植的hAD-MSCs主要定位于梗死區及邊緣區，免疫熒光雙染色結果發現人細胞核抗原與CX-43、α-輔肌動蛋白陽性細胞同時表達，提示移植的hAD-MSCs在MI向心肌細胞分化(圖5)。

2.5 hAD-MSCs經靜脈移植后對心功能的影響 與假手術組比較，模型組大鼠心功能各項指標均發生異常(均P＜0.05)，表現為明顯的收縮和舒張功能障礙。與模型組比較，移植組心功能各項指標明顯改善，尤其是反映左心室收縮功能的EF、FS和反映左心室前壁厚度的LVAWd和LVAWs，明顯高于模型組(P＜0.01)(圖6)。

圖3 hAD-MSCs移植后MI區病理變化(×200)

圖4 hAD-MSCs靜脈移植后6 w在MI區和主要器官中的分布(×200)

圖5 hAD-MSCs移植后6 w在心肌原位表達心肌細胞特異性蛋白

圖6 hAD-MSCs移植后對MI大鼠心功能的影響

3 討論

干細胞移植是近年來心肌損傷修復研究的一個熱點問題，很多動物實驗和臨床研究均證實，干細胞移植對受損心肌組織的修復以及心功能改善有積極的作用。通過何種途徑將移植細胞輸送到受損心肌組織內也成為眾多學者的研究方向。經冠脈內、心內膜和心外膜直視注射移植細胞雖然移植成功率較高，但都因技術要求高及具有創傷性，增加了患者的痛苦，臨床應用受到限制。Orlic等〔6〕嘗試了經靜脈途徑移植干細胞保護梗死心臟，結果表明靜脈移植方式能有效地改善左心室功能，縮小梗死面積。Nagaya等〔7〕從同源大鼠分離出MSCs，通過靜脈注入移植后，發現細胞先到達梗死心肌，且表達心肌特異性標記結蛋白、肌鈣蛋白T、連接蛋白43。本實驗選擇在MI后1 w移植細胞，考慮到MI早期的炎癥性反應不利于細胞的存活，而梗死后1 w炎癥反應漸于消退，很多細胞因子表達處于高峰期，有利于移植細胞向受損區域遷移〔8〕。

肺臟是移植細胞最先移行的臟器，Gao等〔9〕靜脈注射MSCs進行骨組織修復和Fischer等〔10〕靜脈注射MSCs修復豬MI的研究顯示，由于肺的“首關效應”，移植后大部分細胞被肺血管所“俘獲”，使細胞無法通過而導致大量細胞滯留于肺組織中。本研究表明靜脈移植的hAD-MSCs可以通過血液循環遷移到MI區的心肌組織內。此外，在脾臟中也可見少量滯留的細胞，這可能是由于移植細胞受到肺循環中豐富血流不斷沖刷，細胞得以逃逸到其他組織器官中，這些與其他研究結果一致〔11〕。本研究中肝臟組織未見有細胞存留，這可能與細胞遭受炎癥、免疫等因素影響后出現凋亡或死亡，導致細胞數量減少而未檢測到。這些結果表明移植細胞能夠定植于MI區域及周邊區域，并分布在重要器官中，說明供體細胞具有向受損心肌組織遷徙特性，且提示細胞通過簡便的靜脈移植途徑治療MI是可行的。

hAD-MSCs經靜脈注射后不僅有細胞分布到MI區域，而且還能夠保護心臟功能，延緩梗死后左心室的重構。本實驗研究表明移植hAD-MSCs可在一定程度上抑制MI后心室重構，對防止因心室重構而導致的心力衰竭具有積極意義。本實驗說明hAD-MSCs移植后可在大鼠MI區向心肌細胞分化。hAD-MSCs移植可改善MI后心臟功能。即便還沒有證據證明hAD-MSCs分化成的心肌樣細胞直接參與了心臟的收縮功能，但有一點是可以肯定，即hAD-MSCs抑制MI后心室重構是其提高心功能的重要的病理生理學機制。

關于移植細胞對MI后的心肌修復的作用機制尚不十分清楚，可能與供體細胞分化成心肌細胞，促進新生血管形成，通過旁分泌作用抑制心肌細胞凋亡或促進殘留心肌細胞再生等因素有關 。本實驗結果所顯示的hAD-MSCs對MI的修復作用是否與其分化成心肌細胞有關，分化的心肌細胞是否參與了心臟的收縮功能，抑或通過旁分泌作用介導抑制心肌細胞凋亡或促進心肌細胞增生和血管形成，均有待深入研究。

1 Zhao P，Ise H，Hong M，et al.Human amniotic mesenchymal cells have some characteristics of cardiomyocytes〔J〕.Transplantation，2005;79(5):528-35.

2 In't Anker PS，Schergon SA，Kleijburg-vander keur C，et al.Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta〔J〕.Stem Cells，2004;22(7):1338-45.

3 張 路，方 寧，陳代雄，等.人羊膜間充質細胞有向心肌樣細胞分化的特性〔J〕.中國生物工程雜志，2007;27(12):84-9.

4 張 路，方 寧，陳代雄，等.人羊膜上皮細胞有向心肌樣細胞分化的特性〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2008;12(3):401-5.

5 Mu Y，Cao G，Zeng Q，et al.Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors〔J〕.Exp Biol Med(Maywood)，2011;236(9):1100-7.

6 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart，improving function and survival〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2001;98(18):10344-9.

7 Nagaya N，Fujii T，Iwase T，et al.Intravenous administration of mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction through angiogenesis and myogenesis〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004;287(6):2670-6.

8 Lange C，Togel F，Ittrich H，et al.Administered mesenchymal stem cells enhance recovery from ischemia/reperfusion induced acute renal failure in rats〔J〕.Kidney Int，2005;68(4):1613-7.

9 Gao J，Dennis JE，Muzic RF，et al.The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion〔J〕.Cells Tissues Organs，2001;169(1):12-20.

10 Fischer UM，Harting MT，Jimenez F，et al.Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery:the pulmonary first-pass effect〔J〕.Stem Cells Dev，2009;18(5):683-92.

11 Freyman T，Polin G，Osman H，et al.A quantitative，randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction〔J〕.Eur Heart J，2006;27(9):1114-22.

12 Moon JH，Lee JR，Jee BC，et al.Successful vitrification of human amnion-derived mesenchymal stem cells〔J〕.Hum Reprod，2008;23(8):1760-70.

13 Kim DH，Kshiti Z，Smith RR，et al.Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration〔J〕.Integr Biol(Camb)，2012;4(9):1019-33.

14 Tang YL，Zhao Q，Qin X，et al.Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction〔J〕.Ann Thorac Surg，2005;80(1):229-36.