促紅細胞生成素對慢性腦缺血大鼠認知障礙及海馬星形膠質細胞的影響

陳 濤 周少華 劉南暖 葉 飛 章軍建 (武漢大學中南醫院神經內科，湖北 武漢 43007)

慢性腦缺血常伴發于動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病和血管性癡呆等多種病理過程〔1〕。慢性腦缺血的病理過程持續的時間較長，損傷和修復的機制比較復雜，積極研究其病理生理機制可以為臨床上早期藥物干預提供更多的機會。促紅細胞生成素(EPO)及其受體廣泛地存在于在神經系統的神經元、膠質細胞和血管內皮細胞中，在缺血、缺氧和神經系統變性疾病中發揮著保護作用〔2〕。本實驗觀察EPO對慢性腦缺血時大鼠認知功能障礙與海馬CA1區星形膠質細胞的影響，為慢性腦缺血的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組、模型制備和給藥 36只雄性Wistar大鼠(體重300～350 g)，購自四川省醫學科學院實驗動物研究所。隨機分為缺血組，EPO組，假手術組，每組12只。缺血組和EPO治療組將大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉消毒后分離雙側頸總動脈，雙重絲線結扎后切斷。假手術組僅游離雙側頸總動脈。EPO治療組大鼠腹腔內注射EPO 1 000 U/kg(重組人紅細胞生成素產自南京華欣藥業生物工程有限公司)，連續5 d。假手術組及缺血組動物等劑量PBS腹腔注射。

1.2 Morris水迷宮認知功能測試 Morris水迷宮購自中國醫學科學院藥物研究所。正式實驗前1 d三組大鼠在無逃逸平臺的水池中適應性游泳2 min。次日將三組大鼠隨機從四個不同象限入水。以60 s為時限計大鼠從入水至爬上平臺的游泳距離，即隱匿平臺逃避路程。實驗第5天完成逃避路程測試后后撤去平臺，將大鼠從平臺所在的對面象限中放入水池，記錄1 min內大鼠在隱匿平臺所在象限的停留時間。

1.3 免疫組化檢測 Morris水迷宮測試結束后三組大鼠以10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后暴露心臟，通過左心室插管到升主動脈，生理鹽水100 ml快速沖洗;以4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS(pH7.4)400 ml灌注。石蠟包埋后制備含有海馬部位的冠狀腦部石蠟切片。每20張取3片。烤片后脫蠟入雙蒸水，再入PBS沖洗后用濾紙吸干水分后，加入3%H2O2-甲醇30 min，封閉內源性過氧化物酶。按照說明書滴加兔抗GFAP血清(Sigma公司產品)，再滴入生物素化的羊抗兔IgG和SABC液(武漢博士德公司產品)，DAB-0.01%H2O2顯色5 min。以上各步驟間均用PBS充分漂洗。GFAP的陽性對照采用腦膠質瘤切片進行;陰性對照采用PBS代替一抗;其余步驟同上。

1.4 統計學處理 使用SPSS13.0統計軟件，數據以±s表示，結果采用單因素方差分析。相關性分析采用Pearson法。

2 結果

2.1 Morris水迷宮隱匿平臺逃避路程 從圖1結果(Fig1A)可以看到三組大鼠隨著訓練天數增加，尋找隱匿平臺所需的逃避路程逐漸減少，但三組大鼠學習記憶能力不同。缺血組和假手術組從水迷宮訓練的第1天起相比，缺血組比假手術組的隱匿平臺逃避路程明顯延長(F=45.52，P＜0.05)，在第4～5天差異更明顯(F=156.85，P＜0.01)。而EPO組第2天的隱匿平臺逃避距離明顯短于缺血組(F=58.31，P＜0.05)，從第4天后兩者的成績差異比較穩定，而且更具有顯著性(F=76.95，P＜0.01)。

2.2 隱匿平臺象限停留時間 假手術組和缺血組大鼠相比，缺血組大鼠停留隱匿平臺象限時間(9.000±1.78)s明顯短于假手術組大鼠(19.255±3.13)s(t=3.98，P＜0.01)。EPO組的隱匿平臺象限停留時間(15.000±2.29)s同缺血組相比也明顯縮短(t=2.06，P＜0.01)。

圖1 三組大鼠在Morris迷宮內隱匿平臺逃避路程

2.3 海馬CA1區GFAP免疫組化結果以及與大鼠空間學習記憶能力相關性分析 三組大鼠海馬CA1區GFAP陽性細胞數比較見圖2所示。缺血組大鼠海馬CA1區GFAP陽性星形膠質細胞呈蜘蛛狀，胞體肥大、突起增多、增粗、變長以及細胞數目明顯增多(圖2A);假手術組大鼠海馬CA1區也可見到少數GFAP陽性星形膠質細胞，表現為細胞胞體較小、細胞數目很少、突起細短(圖2B);而EPO治療組海馬CA1區GFAP陽性星形膠質細胞反應明顯較缺血組弱(圖2C)(P＜0.01)，同假手術組相比EPO治療組海馬CA1區GFAP陽性星形膠質細胞數目差異無顯著性(t=1.65，P＞0.05)。慢性腦缺血大鼠海馬CA1區GFAP陽性細胞數與大鼠隱匿平臺象限停留時間做相關性分析后結果顯示:大鼠海馬CA1區GFAP陽性細胞數與大鼠停留時間呈負相關性(r=－0.845，F=9.651，P＜0.01)。提示大鼠海馬CA1區GFAP陽性細胞數與其空間學習記憶能力呈負相關。

圖2 三組大鼠海馬CA1區GFAP表達(SABC，×400)

3 討論

EPO是一種造血細胞因子，目前在臨床上廣泛用于腎性貧血等治療中。研究表明EPO可以降低谷氨酸興奮性毒性，誘導神經抗凋亡因子的產生，減少炎癥反應，減少細胞介導產生的TNF，增加IL-1的產生，減少應激反應對神經元的損害，通過抑制NO的過度合成保護神經元，增加神經元的抗氧化酶活性，具有抗氧化效應，能顯著改善認知功能，具有明顯地神經營養和神經保護作用〔3～6〕。

永久性結扎大鼠雙側頸總動脈可出現慢性腦低灌注狀態，目前被公認為是慢性腦低灌注的較理想動物模型〔7〕。Morris水迷宮實驗能排除動物在完成作業而經過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對其他動物檢測結果產生的影響，主要用于評價海馬的認知功能。我們觀察到用Morris水迷宮測試大鼠的空間記憶能力，慢性腦缺血大鼠的空間記憶能力明顯下降，表現為隱匿平臺逃避距離顯著延長，定位能力欠佳，隱匿平臺象限停留時間明顯減少，表明該模型可靠。而給予EPO治療后慢性腦缺血大鼠明顯縮短了逃避距離，增加了停留平臺象限時間，表明EPO可顯著改善認知功能，神經保護效果明顯。

膠質細胞約占中樞神經系統細胞總數的90%，星形膠質細胞是其中主要的組成成分，擔負了膠質細胞的大部分功能:神經發生、發育與再生，合成和分泌細胞因子，血腦屏障，突觸形成和可塑性，免疫應答調節，神經元信號傳遞等〔8，9〕。在致病因素刺激下，膠質細胞可被激活，分泌產生許多細胞因子參與免疫、吞噬及炎癥。研究顯示星形膠質細胞與認知功能損害密切相關〔10～12〕。海馬是參與空間學習記憶的重要結構，并且它對缺血缺氧十分敏感，尤其是CA1區，慢性腦缺血時的腦部低灌注可以引起海馬部神經元損傷，通常認為海馬神經元受損可能是慢性腦缺血大鼠學習記憶能力障礙的病理基礎。龍大宏等〔13〕觀察結果顯示，穹窿海馬傘損害大鼠的學習記憶能力與海馬CA1區和齒狀回內GFAP陽性細胞數密度呈負相關，認為海馬星形膠質細胞參與了學習記憶過程。本實驗提示EPO可能通過抑制星型膠質細胞的反應性增生發揮神經保護作用，從而改善慢性腦缺血大鼠的認知功能。但有關具體機制仍需要下一步深入研究。

1 De La Torre，Jack C.Alzheimer，s disease is a vasocognopathy:a new term to describe its nature〔J〕.Neurol Res，2004;26(5):517-24.

2 Juul S.Erythropoietin in the central nervous system and its use to prevent hypoxic-ischemic brain damage〔J〕.Acta Paediatr Suppl，2002;91:36.

3 Chen ZY，Asavaritikrai P，Prchal JT，et al.Endogenous erythropoietin signaling is required for normal neural progenitor cell proliferation〔J〕.J Biol Chem，2007;282(35):25875-83.

4 Kim SS，Lee KH，Sung DK，et al.Erythropoietin attenuates brain injury，subventricular zone expansion，and sensorimotor deficits in hypoxic-ischemic neonatal rats〔J〕.J Korean Med Sci，2008;23(3):484-91.

5 Wei L，Han BH，Li Y，et al.Cell death mechanism and protective effect of erythropoietin after focal ischemia in the whisker-barrel cortex of neonatal rats〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2006;317(1):109-16.

6 Sun Y，Zhou C，Polk P，et al.Mechanisms of erythropoietin-induced brain protection in neonatal hypoxia-ischemia rat model〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2004;24(2):259-70.

7 Sarti C，Pantoni L，Bartolini L，et al.Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion:what can be learned from experimental models〔J〕.J Neurol Sci，2002;203-4:263-6.

8 Tarkowski E，Liljeroch AM，Minthon L，et al.Cerebral pattern of pro-and antiinflammatory cytokines in dementias〔J〕.Brain Res Bull，2003;61(3):255.

9 Pavelko KD，Howe CL，Drescher KM，et al.Interleukin-6 protects anterior hom neurons from lethal virus-induced injury〔J〕.J Neurosci，2003;23(2):481.

10 劉冬戈，何淑蓉，張 偉，等.阿爾芡海默病神經細胞凋亡與小膠質細胞活化的關系〔J〕.中華病理學雜志，2004;33(5):404-7.

11 Barker AJ，Ullian EM.Astrocytes and synaptic plasticity〔J〕.Neuroscientist，2010;16(1):40-50.

12 Huang Z，Liu J，Cheung PY，et al.Long-term cognitive impairment and myelination deficiency in a rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain injury〔J〕.Brain Res，2009;1301(1):100-9.

13 龍大宏，楊丹迪，李佳楣，等.穹窿海馬傘損傷對大鼠學習記憶和海馬GFAP陽性神經膠質細胞的影響〔J〕.神經解剖學雜志，2002;18(1):63-6.