ASPP1蛋白抗體制備及ASPP1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

關(guān)曉輝 李曉瑩 韓 笑 安麗萍 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 3200)

P53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of P53，ASPP)家族是新近發(fā)現(xiàn)的與P53有關(guān)的腫瘤抑制基因家族。研究此蛋白如何促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為當(dāng)今熱點(diǎn)話(huà)題。現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)了該基因家族的3個(gè)成員:ASPP1、ASPP2和iASPP〔1〕。對(duì)ASPP的調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步探討。通過(guò)抑制iASPP或激活A(yù)SPP來(lái)提高P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。本研究根據(jù)生物信息學(xué)軟件分析人ASPP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、疏水性和抗原性等理化性質(zhì)，經(jīng)同源性檢索，綜合考慮抗體設(shè)計(jì)的其他因素，設(shè)計(jì)一段多肽，制備多克隆抗體。同時(shí)采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測(cè)ASPP1在結(jié)腸癌組織及正常組織中的表達(dá)情況，分析其在分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。為結(jié)腸癌的預(yù)后評(píng)估及指導(dǎo)綜合治療等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 ASPP1抗原與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ASPP1抗原由本實(shí)驗(yàn)室提供，新西蘭大白兔購(gòu)自吉林省生物制品所。

1.1.2 資料選擇 選取北華大學(xué)附屬醫(yī)院2005年1月至2010年12月住院手術(shù)治療的結(jié)腸癌病人30例。其中男性16例，女性14例;平均年齡57.5歲(40～75歲)。正常結(jié)腸黏膜15例，標(biāo)本來(lái)自北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科保存的蠟塊。

1.1.3 試劑盒 S-P免疫組織化學(xué)染色試劑盒為美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。Western印跡試劑盒，購(gòu)自北京西美杰生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要試劑 完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司;人ASPP1蛋白和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Amersham公司。

1.2 研究方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 登錄進(jìn)入http://www.ncbi.nlm.nih.gov，采用Blastn和Blastx程序，進(jìn)行同源性檢索和保守性分析。采用ProtScale程序、ExPASy工具包程序、SWISS PROT蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和DNA star(Protean)生物信息學(xué)軟件對(duì)ASPP1的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、親疏水性、結(jié)合位點(diǎn)、氨基酸的帶電性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2.2 ASPP1多肽的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)，按抗原性、親疏水性和同源性分析，設(shè)計(jì)并合成一段多肽，即ASPP1:NH2-HIVKFLLDFGVNVNAADSDG-COOH。多肽的合成和與載體蛋白-血藍(lán)素聯(lián)接交由北京博奧森生物技術(shù)有限公司完成。多肽的合成采用9-氟甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成多肽片段，利用高效液相法進(jìn)行純化，純化后的樣品再用HPLC分析，純度為95%。

1.2.3 動(dòng)物免疫 純化后的多肽抗原液250 μl與等體積的CFA混合，充分乳化后采用背部多點(diǎn)注射法免疫新西蘭白兔。2 w后取多肽抗原液加等體積IFA同法加強(qiáng)免疫，以后每2 w免疫1次，全程免疫5次。末次免疫后5～7 d耳緣靜脈采血，間接ELISA法檢測(cè)血清達(dá)理想效價(jià)后頸動(dòng)脈放血，收集兔血清。

1.2.4 免疫兔血清采集及純化 采用頸總動(dòng)脈放血法收集兔血清。鹽析法初步純化兔血清。

1.2.5 間接ELISA方法測(cè)定血清效價(jià) 于注射免疫程序開(kāi)始前和每次注射免疫后1 w，從兔耳緣靜脈取血1 ml，離心取上清測(cè)定血清效價(jià)。經(jīng)過(guò)包被，洗滌，封閉，洗滌，加一抗，洗滌，加二抗，洗滌，顯色，終止反應(yīng)等過(guò)程。酶標(biāo)儀測(cè)定A492值，以(被檢標(biāo)本值－空白值)/(陰性對(duì)照值－空白值)即P/N≥2.1為陽(yáng)性。

1.2.6 多克隆抗體的Western印跡鑒定 蛋白SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜，以純化的免疫兔血清為一抗，羊抗兔HRP-IgG抗體為二抗，以免疫前兔血清為陰性對(duì)照，通過(guò)ECL顯色系統(tǒng)進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色方法 取組織切片，其中結(jié)腸癌組織30例，正常結(jié)腸組織15例，應(yīng)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素染色進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(SP法)。

1.2.7.1 免疫組織化學(xué)染色步驟 切片脫蠟，水化，水浴法抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性氧化物酶活性。正常血清孵育，滴加ASPP1抗體，4℃過(guò)夜，依次經(jīng)PBS洗滌，孵育，DAB染色后，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.2.7.2 檢查結(jié)果判斷 用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。染色結(jié)果判定以腫瘤細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，高倍鏡下取4個(gè)視野個(gè)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比將染色結(jié)果分為:陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為(－);陽(yáng)性細(xì)胞5% ～25%為(+);陽(yáng)性細(xì)胞25% ～50%為(?);陽(yáng)性細(xì)胞＞50%為(?)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，采用計(jì)數(shù)資料四格表及四格表的確切概率法相關(guān)分析等方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多肽抗體的制備和效價(jià) 以合成的多肽為抗原包被酶標(biāo)板，鑒定制備的兔抗血清是否具有識(shí)別多肽抗原的免疫反應(yīng)性。結(jié)果顯示ASPP1肽段具有良好的免疫原性，在接受第1次免疫后2 w即第3周，體內(nèi)抗體滴度開(kāi)始上升，5次主動(dòng)免疫結(jié)束后即第9周，兔抗血清與多肽抗原發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng);對(duì)照組兔血清不與多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。家兔免疫后獲得的血清進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)S著血清稀釋度的增加，其反應(yīng)孔OD值降低，以P/N≥2.1為陽(yáng)性，間接ELISA測(cè)定效價(jià)均＞1∶160 000，表明獲得高效價(jià)的多抗。

2.2 多肽抗體的特異性 為了檢測(cè)兔血清的特異性，筆者將ASPP1蛋白經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以免疫兔血清進(jìn)行Western印跡分析。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)印至PVDF膜上的ASPP1、蛋白與免疫兔血清分別在約120 kD、124 kD和91 kD處形成單一陽(yáng)性染色帶，與其蛋白分子量的理論值相符;兔陰性對(duì)照血清無(wú)條帶出現(xiàn);表明獲得了抗ASPP1的多克隆抗體(圖1)。

圖1 抗ASPP1的多克隆抗體Western印跡分析

2.3 免疫組化結(jié)果 ASPP1主要在癌細(xì)胞胞漿中表達(dá)，為胞漿內(nèi)出現(xiàn)粗細(xì)不一的棕黃色顆粒，在一小部分結(jié)腸癌的細(xì)胞核中也有弱陽(yáng)性表達(dá)。ASPP1在分化程度上的表達(dá)有顯著差異性(P＜0.05)(圖2)。ASPP1在癌組織的高、中、低分化程度上的表達(dá)表現(xiàn)為分化程度越低，其表達(dá)越弱。在浸潤(rùn)深度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)(表1)。ASPP1在結(jié)腸癌與正常結(jié)腸組織中比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)(表2)。

圖2 免疫組化結(jié)果(×10)

表1 ASPP1與結(jié)腸癌的組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性〔n(%)〕

表2 ASPP1在結(jié)腸癌組織、正常組織中的表達(dá)〔n(%)〕

3 討論

結(jié)腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)生是多種因素相互作用的結(jié)果，其中結(jié)腸腺瘤是結(jié)腸癌發(fā)生的重要病因之一〔2〕。結(jié)腸癌的腺瘤-癌序列學(xué)說(shuō)中，細(xì)胞增殖與凋亡失衡是結(jié)腸癌發(fā)生的重要機(jī)制。

凋亡是一種細(xì)胞受環(huán)境刺激后，在基因調(diào)控之下所產(chǎn)生的自然死亡現(xiàn)象，在這一機(jī)制下，失去作用或已經(jīng)受損的細(xì)胞會(huì)自我毀滅。在抗腫瘤的研究中對(duì)抑癌基因是如何調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡研究最多。P53是目前公認(rèn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性最高的抑癌基因之一〔3〕，近年新發(fā)現(xiàn)的ASPP蛋白家族是P53的凋亡刺激蛋白，對(duì)P53起調(diào)控作用。ASPP家族與P53作用總的機(jī)制為:ASPP與P53結(jié)合形成ASPP-P53復(fù)合物作用于原凋亡基因啟動(dòng)子，ASPP的微小變化就可引起P53結(jié)合DNA的能力發(fā)生改變，從而影響P53誘導(dǎo)凋亡的能力。ASPP1、ASPP2與iASPP作用相反，iASPP是與ASPP1和ASPP2競(jìng)爭(zhēng)與P53的結(jié)合位點(diǎn)，影響ASPP-P53復(fù)合物與DNA結(jié)合的能力，從而阻止 P53 的細(xì)胞凋亡功能〔4，5〕。

Liu等〔6，7〕研究發(fā)現(xiàn)在白血病細(xì)胞中 ASPP1和 ASPP2的mRNA低表達(dá)與iASPP高表達(dá)共存的現(xiàn)象，提示了ASPP1和ASPP2的表達(dá)升高和下調(diào)iASPP的表達(dá)也許在治療白血病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

Lossos等〔8〕用RT-PCR和免疫組化等方法對(duì)彌漫性大B淋巴細(xì)胞瘤(DLBCL)和濾泡性淋巴瘤(FCL)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ASPP1表達(dá)高的患者存活時(shí)間長(zhǎng)，而ASPP1表達(dá)低的患者存活時(shí)間短。

以上研究證明，ASPP蛋白是體內(nèi)《53的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，ASPP1和ASPP2通過(guò)提高原凋亡基因的活力促進(jìn)P53依賴(lài)的細(xì)胞死亡。由于目前相關(guān)文獻(xiàn)較少，對(duì)ASPP蛋白家族的認(rèn)識(shí)尚在初步階段，所以還需進(jìn)一步研究和認(rèn)知。本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了ASPP1的表達(dá)與結(jié)腸癌組織學(xué)分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)因素的關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道，在正常成人組織中，ASPP1有高表達(dá)，而癌組織中，ASPP1表達(dá)下降，這與本研究結(jié)果部分相符合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)腸癌組織與正常結(jié)腸組織中ASPP1的表達(dá)情況如下:結(jié)腸癌組織中ASPP1的陽(yáng)性表達(dá)率為86.7%，正常結(jié)腸組織中ASPP1的陽(yáng)性表達(dá)率為93.3%，結(jié)腸癌組織中ASPP1陽(yáng)性表達(dá)率較正常結(jié)腸組織低，但兩者比較分別無(wú)顯著差異性(P＞0.05)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可能與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果部分不一致，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與標(biāo)本數(shù)目較少及地區(qū)差異有關(guān)，還需增大樣本量繼續(xù)研究與探討，尋找特異性較好的指標(biāo)，為結(jié)腸癌的預(yù)后評(píng)估及合理的綜合治療等提供有力的理論依據(jù)。隨著對(duì)腫瘤研究的深入，ASPP家族可以作為腫瘤早期診斷、治療和預(yù)后判斷的一個(gè)新靶點(diǎn)。即可以考慮通過(guò)提高ASPP1，ASPP2的高表達(dá)，抑制iASPP的表達(dá)來(lái)提高野生型P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的作用。

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