柞蠶絲素蛋白-羥基磷灰石-BMSCs組織工程化骨修復老齡動物骨缺損

張繼波 楊依勇 孔令菊 裴 丹 姚素艷 鄭德宇 (遼寧醫學院解剖學教研室，遼寧 錦州 00)

現代骨修復技術主要有自體骨移植、異體(同種或異種)骨移植和人工骨材料移植。作為治療骨缺損金標準的自體骨移植和標準方法的同種異體骨移植〔1～6〕，因其缺點如自體骨移植的骨來源有限、量不足、副損傷大、供區感染等，異體骨移植可傳播疾病、免疫排斥反應、倫理等問題，導致兩種骨移植方法受到限制。人工骨對于修復骨缺損的價值逐漸顯現，但良好的人工骨材料應滿足以下特點:①無毒;②具有一定的機械強度;③良好的生物相容性;④生物降解性和降解速率與骨修復速率匹配等。單一的材料不足以滿足上述要求，故研制復合型生物活性支架材料是21世紀人工骨研究面臨的挑戰〔7〕。本實驗將柞蠶絲素蛋白-羥基磷灰石(TSF-HA)與兔骨髓間充質干細胞(BMSCs)復合構建新的組織工程骨，用于修復老齡兔橈骨缺損，探討此種新型植骨材料的骨缺損修復作用，希望為臨床治療骨缺損提供一種新的人工骨材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 成骨誘導劑:β-甘油磷酸鈉(美國Sigma公司)、地塞米松(美國Sigma公司)、L-抗壞血酸(美國Sigma公司)。條件培養液:DMEM培養液中加入成骨誘導劑，構成條件培養液。

1.1.2 實驗材料及實驗動物 將TSF-HA復合材料制成1.5 cm×0.3 cm×0.3 cm長方體，與兔橈骨的粗細形狀相近似，包裝后經60Co消毒備用，該材料由遼寧醫學院解剖教研室鄭德宇和楊依勇提供。TSF-HA參數為:空隙率66%，平均孔徑80 μm，表觀密度0.76 g/cm3，壓縮強度10.1 MPa。新西蘭大耳白兔，12月齡，體質量1 800～2 000 g，雌雄不限(由遼寧醫學院實驗動物中心提供)。

1.2 試驗方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養及其成骨誘導 取出生24 h的乳兔，斷頸處死，將其浸泡入75%酒精中20 min，無菌分離四肢骨，放入含雙抗(青霉素200 U/ml、鏈霉素200 mg/ml)的 PBS緩沖液內，沖洗2次。更換培養皿，快速清除骨膜等結締組織，剪去兩端骨骺，注射器吸取完全培養基(DMEM，10%FBS，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/ml)沖洗骨髓腔。將沖洗液離心(1 000 r/min，10 min)，棄上清液，吹打管反復吹打底部細胞。加入完全培養液，按1×106/ml的密度接種于25 ml培養瓶中，置于37℃，50 ml/L CO2飽和濕度條件下的培養箱進行培養。48 h后換液，以后每隔2～3 d換液1次。待細胞達80% ～90%融合后，0.25%胰酶消化，1∶3傳代分瓶培養，記為P1。細胞生長再次鋪滿瓶底匯合時消化傳代，記為P2。取P2代BMSCs，加入條件DMEM培養液，每隔3 d換液，進行成骨方向的定向誘導培養。待培養皿內單層細胞生長近匯合時消化傳代，記為P3。繼續使用條件培養液培養，用于后續實驗。

1.2.2 材料與細胞共培養 無菌條件下將已滅菌的TSF-HA復合支架材料置入裝有條件培養液培養皿中浸泡24 h預濕，紫外線照射下自然晾干。將經過條件培養液誘導后生長良好的第3代BMSCs消化、離心，以5×107/ml密度均勻滴加在預濕的支架材料上，接種后靜置于37℃、體積百分比為5%CO2和100%濕度孵箱中培養4～6 h;然后加入條件培養液完全覆蓋復合物，繼續培養3～5 d備用。

1.2.3 實驗動物分組及兔橈骨缺損模型的建立 新西蘭老齡大耳白兔共54只(隨機分3組:A、B、C組各18只)適應性飼養7 d后，予質量百分比為10%的水合氯醛耳緣靜脈+腹腔各半量麻醉生效后，無菌操作下，于左前臂內側中上段縱行約3 cm直切口，切開皮膚、皮下組織及深筋膜，沿肌間隙進入，充分暴露橈骨中下段，用牙科鉆將長15 mm橈骨連同骨膜一并截除，造成節段性骨缺損。A組植入TSF-HA+BMSCs復合物，B組單純植入TSF/HA，C組骨缺損區不植入任何材料。縫合皮下組織及皮膚，再次安爾碘消毒切口，患肢不行內外固定。術前肌肉注射青霉素20萬 U/d，術后再次肌肉注射青霉素20萬U/d，連續3 d，常規喂養。

1.2.4 觀察指標 (1)觀察術后老齡日本大耳白兔活動、進食、傷口愈合情況。(2)分別于術后8、12 w，每次隨機選取6只兔麻醉后攝前肢正位X線片，觀察各組橈骨缺損的骨修復程度;然后在麻醉狀態下注入空氣處死，取標本行肉眼觀察及HE染色組織學觀察骨缺損的修復水平。

2 結果

2.1 細胞培養及TSF-HA-BMSCs復合物的構建 原代培養的BMSCs呈長梭形或多角形，經成骨誘導后大約85%的細胞ALP染色呈陽性，說明細胞具有了骨系細胞的特點。誘導后的BMSCs與材料復合培養3 d后，可見細胞在材料表面生長狀態良好，伸出偽足，并與材料緊密相貼。說明構建出了TSF-HA-BMSCs復合植骨材料(圖1)。

圖1 TSF/HA/BMSCs材料的構建

2.2 實驗動物觀察 術后動物體溫、飲食正常，外界環境刺激敏感，切口無紅腫、滲液等炎性反應。

2.3 影像學檢查 4 w時復合支架組骨折端與支架開始交錯，支架邊緣隱約可見少量骨痂;單純材料組清晰可見骨折端與支架間隙，未見明顯骨痂形成。8 w時復合支架組骨折端與支架連接，支架降解，被大量骨痂覆蓋;單純支架組骨折端與支架間隙模糊，支架周圍可見骨痂。12 w時復合材料組支架已基本被骨痂取代，骨密度較高，骨髓腔形成;單純支架組可見部分支架，并與骨折端結合緊密，骨密度也增高;空白組骨折缺損處見有瘢痕愈合，由周圍軟組織填充，未見明顯新生骨，趨向骨不連(圖2)。

由圖中可見8 w時實驗組支架與骨折處緊密相連出現大量骨痂圍繞支架;對照組支架與骨痂雖相連，但仍有一定的間隙。12 w時實驗組支架大部分被吸收，骨密度增高，骨修復良好;對照組骨痂增多，但仍可見部分支架;空白組骨缺損幾乎沒有骨修復現象，被周圍結締組織填充。

圖2 實驗動物的X線攝片

2.4 大體觀察 各組植入的支架材料在骨創區無移位，材料的周圍組織未見變性、壞死、化膿、積液等不良跡象。(1)8 w時，實驗組出現骨質較薄的骨痂樣硬組織，標本表面較為光滑，漸變暗紅色，表面見少量支架;對照組材料周圍顏色有變紅趨勢，支架開始降解。(2)12 w時，實驗組骨創區呈現乳白色，可見血管，新生出皮質骨與骨折端皮質連續，骨修復完成;對照組仍有部分支架露出骨外，與骨痂相連，骨修復部分完成;空白對照組骨缺損區被周圍結締組織覆蓋，未見明顯骨痂。

2.5 組織學檢查 4 w時鏡下見A組有大量成纖維骨痂及少量成骨細胞，材料開始被降解;B組骨創區有少量纖維骨痂形成。8 w時A組出現大量較成熟的骨組織結構，周邊可見成骨細胞，類似骨單位結構;B組支架開始降解，缺損區見大量纖維組織增生，邊緣少量成骨細胞。12 w時，A組新生骨改建完成，材料周圍見大量成熟的新生骨組織;B組出現新生骨組織，缺損區仍有部分纖維組織;C組缺損區見大量致密結締組織(圖3)。12 w時實驗組支架幾乎完全被降解，周圍出現大量骨組織，對照組新生成骨細胞較實驗組少，空白組見大量纖維結締組織。

圖3 12 w時各組組織學變化(HE染色，×400)

3 討論

我國上世紀80年代四川大學和武漢工業大學等根據人體骨無機成分的主要成分羥基磷灰石(HA)，先后研制出了HA支架材料，作為人體硬組織修復和替代組織工程材料，并很快應用于臨床。但因HA質脆、吸收性差、不易降解等導致臨床使用受到限制〔8〕。絲素蛋白是從天然蠶絲中提取出的天然纖維蛋白，具有獨特機械特性和生物相容性，類似骨組織中的膠原，具有膠原的一些特性，但SF膜在體內引起的炎癥反應要小于膠原蛋白膜〔9〕。通過RGD多肽表面修飾的絲素蛋白支架材料，能明顯促進BMSCs在支架材料上黏附和鋪展，但對細胞增殖作用不明顯〔10〕。柞蠶絲蛋白不但具有家蠶絲素蛋白的特性，而且還含有大量的 Arg-Gly-Asp(精氨酸-乙氨酸-天門冬氨酸，RGD)三肽序列。RGD序列作為細胞膜整合素受體與細胞外配體相結合的識別位點，介導細胞與細胞外基質及細胞之間的相互作用，能夠促進支架對細胞的黏附和伸展，利用細胞間信息傳遞。將羥基磷灰石多孔支架材料浸泡在柞蠶絲素蛋白的水溶液中，采取冷凍干燥制備的方法，進行羥基磷灰石支架表面修飾，制備的TSF-HA復合多孔支架材料達到優勢互補的作用，并且材料價格低廉，制備工藝簡單。

研究結果顯示，TSF-HA復合支架材料構建的組織工程化骨有很好的成骨作用，與宿主骨直接鍵合〔11〕。放射學和組織學評分結果顯示，15 mm的骨缺損在12 w左右能完全被TSFHA組織工程骨所替代和修復，骨皮質橋連接和髓腔相通，支架材料降解完畢。這表明BMSCs被支架載入體內后，細胞能在支架上繼續生長、繁殖、分化，并發揮了成骨活性，說明TSF-HA無毒、具有良好的組織相容性和成骨作用，能作為治療骨缺損的骨組織工程支架材料。

組織工程支架材料的吸水率及降解性吸水率是評價支架材料化學性質和自身結構的一個綜合指標。它既反映了支架的有效孔隙率，又反映了支架本身的親疏水性及降解性。羥基磷灰石的降解吸收分主動和被動兩種方式。被動吸收主要是指支架的孔徑、孔隙率，其孔隙率越大，吸水性也越大，降解速率也越快〔12〕;主動吸收則與成骨細胞活性有關。文獻報道，最有利于成骨細胞滲入到內部的孔徑要大于40 μm，孔隙率達到70%;當孔徑在150 μm，孔隙率大于30%能為骨組織長入提供理想的場所〔13〕。筆者制作的TSF-HA支架，無論是孔徑大小，還是孔隙率與HA支架都相差無幾，基本符合以上標準。雖然兩種材料孔隙率、孔徑大小基本相同，但TSF-HA支架孔隙壁上吸附大量絲素蛋白顆粒，絲素蛋白作用于HA表面，與成骨細胞產生良好的親活性，加大細胞的黏附、細胞間信號的聯系促進成骨細胞的生長;同時絲素蛋白具有良好的親水性，羥基磷灰石吸水性增加促使羥基磷灰石鈣離子析出，從而誘導羥基磷灰石形成晶體狀結構。結晶隨著時間的延長，絲素蛋白的增多而不斷增加，尤其這些結晶的結構、形態和人骨組織中的納米微晶非常相似〔14〕。本實驗結果顯示:12 w左右TSF-HA組織工程化骨完成了對骨缺損的修復，與易誠青等〔15〕的研究結果相符，降解率適宜，作為骨缺損的爬行替代材料組織工程化骨可較快被自身骨組織取代，完成骨修復，基本符合現代骨組織工程學的標準。TSF-HA組織工程化骨克服了單純HA降解極差的不足，顯示了TSF-HA作為理想人工骨的良好前景，有望成為一種新的、優良的骨組織工程支架材料。對于TSF如何改變HA的理化性能、復合支架與BMSCs間和細胞與細胞間的相互作用，成骨等機制還不十分清楚，這些問題有待于進一步研究。

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