自發性高血壓大鼠心室重構及脂聯素受體1的表達

林書坡 周更蘇(邢臺市人民醫院心內科，河北 邢臺 054000)

脂聯素(APN)具有改善胰島素抵抗、抗動脈粥樣硬化、抗炎等作用。APN主要通過與其靶器官和組織上相應受體結合而發揮其病理生理作用。近來研究發現，APN與高血壓所致的心室重構有密切關系，APN可能對心室重構有抑制作用〔1〕。Yamauchi等〔2〕于2003年首次克隆出人類和小鼠脂聯素受體。APN主要有兩種受體:脂聯素受體1(AdipoR1)和脂聯素受體2(AdipoR2)。心肌組織主要表達AdipoR1〔3〕。目前，關于心肌組織AdipoR1與高血壓所致心室重構研究較少。因此，本研究擬通過對SHR大鼠心室重構情況和心肌AdipoR1及其mRNA表達水平的變化研究，旨在探討AdipoR1在高血壓所致心室重構中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級12周齡雄性自發性高血壓大鼠(SHR)為實驗組，相同周齡的雄性京都Wistar大鼠(WKY)為對照組，每組8只。體重(271±30)g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號為SCXK(京)2007-0001。自由飲食，每兩周測一次血壓和體重，12 w后進行超聲心動圖檢查及取材測定各指標。

1.2 主要的試劑與儀器 兔抗大鼠AdipoR1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)、β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)、Trizol Reagent(美國 Invitrogen Life Technologies公司)、RT-PCR試劑盒和 DNA Marker(大連 TaKaRa公司)、PCR引物(北京華大基因公司合成)、凱基全蛋白提取試劑盒(南京凱基生化有限公司)、硝酸纖維素膜(Millopore公司)、羥脯氨酸測定試劑盒和Masson染色試劑盒(南京建成生物公司)、Philips iE33型彩色多普勒超聲儀(Philips公司)、PCR擴增儀(德國Biometra)。

1.3 大鼠收縮壓的測量 應用尾套式小動物血壓測量計測定大鼠血壓，步驟如下:固定大鼠尾部，于白熾燈下照射加熱約10 min，使大鼠尾部血管擴張后將尾部套于壓敏傳感器上。在大鼠清醒、安靜的狀態下，應用生物信號采集處理系統直接同步記錄尾動脈壓力和脈搏曲線，當出現第1個脈搏波時向尾套氣囊內充氣，逐漸阻斷大鼠尾動脈血流直至脈搏波完全消失，然后放氣至第1個脈搏波重新出現，此波所對應的壓力值即為收縮壓。

1.4 超聲心動圖評價大鼠左心室結構和功能 腹腔注射3%戊巴比妥鈉35 mg/kg麻醉大鼠后，胸部備皮，仰臥位固定，略向左側傾斜，將探頭置于大鼠胸部正中位或略偏左對大鼠進行超聲檢查，取得滿意的胸骨旁左心室長軸二維圖像后，M型超聲心動圖測定左心室舒張末期內徑(LVEDD)、舒張末期室間隔厚度(IVST)及左室后壁厚度(LVPWT)。調整脈沖多普勒掃描速度，將取樣容積放在二尖瓣與左室流出道之間描記多普勒血流頻譜圖，測定二尖瓣口舒張早期和舒張晚期血流E峰、A峰峰值流速，計算E/A比值。

1.5 左心室重量指數(LVWI)的測量及心肌標本的采集 采血后迅速取出心臟，生理鹽水沖洗殘血，濾紙吸干，去除大血管殘根和結締組織，沿房室交界處剪去心房，沿室間隔剪去右心室，保留室間隔和左心室，稱左心室重量。LVWI=左心室重量(mg)/體重(g)。切取部分左室游離壁心肌，4%多聚甲醛中固定備用。其余心肌置液氮罐中冷凍后，－70℃冰箱保存備用。

1.6 心肌形態學觀察 心肌形態學觀察心肌組織HE染色，觀察組織病理形態學變化。Masson染色，光鏡下觀察并拍片，用圖像分析系統測定并計算心肌膠原容積分數(CVF)。CVF=心肌膠原面積/所測視野面積，所有標本均隨機取4個視野測量，取平均值。

1.7 羥脯氨酸(Hyp)含量測定 取凍存心肌100 mg，脫水，脫脂，將沉淀烘干并研成粉末。取20 mg干粉，加入6 mmol/L HCl 3 ml，放入試管中于95℃水浴20 min，冷卻后用6 mmol/L NaOH調pH值至6.0，加水至10 ml，3 500 r/min離心10 min。過濾取上清液，按照Hyp檢測試劑盒的要求檢測，計算Hyp含量。

1.8 RT-PCR方法檢測心肌組織AdipoR1 mRNA表達 Trizol一步法提取總RNA，利用紫外分光光度計測定并計算總RNA濃度和純度，將總RNA濃度經DEPC處理的雙蒸水調整至1 μg/μl，按照RT-PCR試劑盒說明，用 AMV逆轉錄酶將 RNA逆轉錄為cDNA。設計并合成大鼠AdipoR1引物，上游引物序列:5'-ATCCGCAGGTCAACG-3'，下游引物序列:5'-GGAGGAGGGCATAGGT-3'，PCR擴增片段長度526 bp。選用β-actin為內參照，上游引物序列5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'，下游引物序列5'-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3'，PCR擴增片段長度701 bp。擴增條件為 94℃ 5 min，98℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72℃ 1 min，共30個循環，72℃ 10 min。取10 μl擴增產物2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統上顯影照相，用凝膠成像分析軟件分析，計算AdipoR1 mRNA的相對表達量。AdipoR1 mRNA表達量的相對值=AdipoR1基因擴增條帶的灰度值/β-actin基因擴增條帶的灰度值。

1.9 Western印跡方法檢測心肌AdipoR1蛋白的表達 取凍存心肌組織100 mg勻漿器勻漿，凱基全蛋白提取試劑盒提取心肌組織總蛋白質，Bradford法蛋白定量，取標本蛋白50 μl上樣，經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠(10%SDSPAGE)電泳分離蛋白，轉移至硝酸纖維素膜，5%去脂奶粉的TTBS封閉4℃過夜。TBS洗膜5 min×3次，加入1∶400稀釋的AdipoR1兔抗大鼠多克隆抗體、β-actin小鼠抗大鼠單克隆抗體，室溫下2 h。清洗:TTBS洗5 min×2次，TBS洗5 min×1次。酶顯法顯色劑顯色。掃描，凝膠成像分析系統成像，測定各條帶灰度值，記錄結果。計算各蛋白帶灰度值/內參β-actin蛋白灰度值的比值。

2 結果

2.1 收縮壓變化 SHR組大鼠收縮壓隨周齡的增長而逐漸升高，而WKY組收縮壓無顯著變化。兩組收縮壓在同一時期均具有顯著差異(P＜0.01)。見圖1。SHR大鼠具有收縮壓持續升高的特點，是研究高血壓的理想動物模型。

2.2 超聲心動圖各指標的比較 與WKY組相比，SHR組IVST和LVPWT均增加，LVEDD和E/A值降均低，具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。各組大鼠左室壁及室腔各切面顯示較清晰。提示SHR大鼠心室肥厚和左室舒張功能有所降低。

2.3 LVWI的比較 SHR組大鼠LVWI明顯升高，與WKY組比較差異顯著(P＜0.05)。見表2。

2.4 心肌形態學的改變 WKY組大鼠心肌細胞大小及染色未見異常，排列規整;SHR組大鼠心肌纖維體積增大，染色相對不均勻，排列紊亂，心肌纖維，心肌間質成纖維細胞肥大增生。見圖2。

2.5 心肌組織Masson染色及CVF的比較 Masson染色下心肌細胞呈紅色，膠原呈藍色。WKY組大鼠心肌間質可見少量膠原，主要位于血管周圍。SHR組大鼠心肌組織中膠原明顯增多，呈柵欄狀排列緊裹心肌細胞。見圖3。SHR組CVF顯著高于WKY組(P＜0.05)。見表2。

2.6 心肌組織Hyp含量的比較 SHR組Hyp含量顯著高于WKY組(P＜0.05)。Hyp含量可反映心肌膠原含量，結果提示SHR大鼠心肌膠原增多。見表2。

表1 各大鼠超聲心動圖指標比較(n=8，±s)

表1 各大鼠超聲心動圖指標比較(n=8，±s)

與WKY組比較:1)P＜0.05

組別 IVST(mm)LVPWT(mm)LVEDD(mm)E/A WKY組1.37±0.17 1.28±0.08 6.19±0.34 1.90±0.05 SHR組 1.67±0.191)1.53±0.161)5.24±0.211)1.52±0.111)

圖1 各組大鼠收縮壓水平的變化

圖2 心肌形態學改變(HE，×400)

圖3 心肌Masson染色(×400)

表2 各組LVWI、CVF、Hyp含量比較(n=8，±s)

表2 各組LVWI、CVF、Hyp含量比較(n=8，±s)

與WKY組比較:1)P＜0.05

組別 LVWI(mg/g) CVF(%) Hyp(μg/g)WKY組2.59±0.09 3.17±0.31 326.4±37.5 SHR組 2.93±0.121) 6.25±0.291) 523.8±65.31)

2.7 心肌AdipoR1 mRNA表達的比較 SHR組心肌組織AdipoR1 mRNA表達(0.39±0.03)顯著低于 WKY組(0.78±0.06)，具有統計學意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 RT-PCR分析AdipoR1 mRNA在心肌的表達

2.8 心肌AdipoR1蛋白表達的比較 與WKY組(0.73±0.26)相比，SHR組(0.37±0.03)心肌組織 AdipoR1蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)。見圖5。

圖5 Western印跡方法分析心肌組織AdipoR1蛋白表達

3 討論

APN是由Scherer等〔3〕于1995年在小鼠脂肪細胞中發現一種新的蛋白質。脂聯素主要在脂肪細胞表達，現已發現機體多種組織均有表達。以往研究顯示，脂聯素具有調節糖脂代謝、改善胰島素抵抗、抗動脈粥樣硬化、抗炎等作用。APN以內分泌方式循環于血液中，通過與其靶器官和組織上相應受體結合而發揮其病理生理作用。

2003 年，Yamauchi等〔2〕首次克隆出人類和小鼠脂聯素受體，并發現有2種APN受體:AdipoR1和AdipoR2。人和鼠AdipoR1基因有96.8%的同源性。AdipoR1主要表達在骨骼肌細胞，對APN的球狀結構域具有高親和力，但對全長APN親和力低。而AdipoR2主要表達在肝細胞，對兩者具有中等親和力。此外，內皮細胞、單核細胞、胰島β細胞、巨噬細胞和受損血管內皮細胞等均有APN受體的表達。有研究證明，AdipoR1和AdipoR2也存在于心肌細胞，其中以AdipoR1為主〔4〕。APN受體包含7個跨膜結構域，但它們的N端在細胞內，C端在細胞外，這與G蛋白偶聯受體的結構相反，因此APN受體可能不與G蛋白偶聯發揮作用，而直接激活下游一些信號分子如過氧化物酶體增殖物激活受體 α(PPARα)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和p38絲裂原活化蛋白激酶而發揮作用。

最近越來越多的研究發現，APN與高血壓發生密切相關。Matsubara等〔5〕研究表明，血漿APN的濃度在高血壓患者低于正常人群。Kubota等〔6〕發現APN敲除(KO)小鼠在動脈受機械損傷后內膜增生比野生小鼠嚴重，而感染攜帶有APN基因的腺病毒之后卻能完全扭轉動脈內膜的過度增生，證明脂聯素是內生的血管保護者。越來越多的研究支持APN作為一種保護因子參與高血壓的發生。APN可能是通過調節血管結構和功能以及調節血脂等作用而對高血壓產生間接作用。

關于APN與高血壓靶器官損害方面的研究較少。Mitsuhashi等〔1〕研究發現低脂聯素是左室肥厚的獨立危險因素。Shibata等〔7〕研究也表明，在APN基因敲除小鼠，用壓力負荷方式極易誘導出心肌肥厚，增加死亡率。而將腺病毒攜帶的APN基因重新轉入體內后可以逆轉這種趨勢。Huang等〔8〕最新研究發現，APN和AdipoR1在體外培養的大鼠成纖維細胞高度表達，APN對成纖維細胞增生有抑制作用。目前APN在高血壓心肌重構中作用機制尚不清楚?？赡軝C制為高血壓時壓力負荷增加、交感神經興奮等因素導致兒茶酚胺增多和RASS激活，這些神經體液因子可以作用于脂肪細胞以及其他能分泌APN的組織細胞，使得脂聯素分泌減少，同時，下調心肌細胞膜上AdipoR1表達，從而使磷酸腺苷激活的蛋白激酶磷酸化激活減少〔7〕，使心肌能量代謝發生障礙及其對蛋白合成抑制作用減弱，導致高壓力負荷狀態下心室重構的發生。目前，關于這一機制的研究較少。本研究發現24周齡SHR有心室重構發生，SHR大鼠發生了左室心肌肥厚。另外，Hyp是機體膠原蛋白特有的一種氨基酸，除彈性蛋白含有少量羥脯氨酸(1%)外，幾乎所有Hyp都存在于膠原蛋白中。本研究提示心肌間質發生一定程度的纖維化，心肌AdipoR1表達的下調可能與高血壓心室重構有關。至于APN與AdipoR1結合后是通過AMPK信號通路還是其他的信號通路，或者各通路共同作用而在高血壓心室重構發揮作用，尚不清楚，還有待更深入的研究。

隨著人們對APN及其受體在高血壓以及高血壓心室重構發病機制中研究的不斷深入，人們將會逐漸認清其作用機制，AdipoR1激動劑有可能成為臨床新藥研發和高血壓及高血壓靶器官損害治療的新思路。

1 Mitsuhashi H，Yatsuya H，Tamakoshi K，et al.Adiponectin level and left ventricular hypertrophy in Japanese men〔J〕.Hypertension，2007;49(6):1448-54.

2 Yamauchi T，Kamon J，Ito Y，et al.Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects〔J〕.Nature，2003;423(6941):726-9.

3 Scherer PE，Williams S，Fogliano M，et al.A novel serum protein similar to Clq，produced exclusively in adipocytes〔J〕.J Biol Chem，1995;270(45):26746-9.

4 Fujioka D，Kawabata K，Saito Y，et al.Role of adiponectin receptors in endothelin-induced cellular hypertrophy in cultured cardiomyocytes and their expression in infarcted heart〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;290(6):2409-16.

5 Matsubara M，Maruoka S，Katayose S.Inverse relationship between plasma adiponectin and leptin concentrations in normal-weight and obese women〔J〕.Eur J Endocrinol，2002;147(2):173-80.

6 Kubota N，Terauchi Y，Yamauchi T，et al.Disruption of adiponectin causes insulin resistance and neointimal formation〔J〕.J Biol Chem，2002;277(29):25863-6.

7 Shibata R，Ouchi N，Ito M，et al.Adiponectin-mediated modulation of hypertrophic signals in the heart〔J〕.Nat Med，2004;10(12):1384-9.

8 Huang D，Yang C，Wang Y，et al.PARP-1 suppresses adiponectin expression through poly(ADP-ribosyl)action of PPAR gamma in cardiac fibroblasts〔J〕.Cardiovasc Res，2009;81(1):98-107.