二硫代氨基甲酸吡咯烷聯合卡鉑對U251神經膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響

王文新，邱建武

（遼寧醫學院附屬：1.研究生學院；2.第一醫院神經外科，遼寧錦州121001）

核轉錄因子－κB（nuclear factor－kappa B，NF－κB）是一類廣泛存在于細胞中的多顯性核轉錄因子，可以調控多種基因的轉錄和表達，與腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡關系密切，在腫瘤的發生、發展中起重要作用［1］。異常的NF－κB活性在人類惡性膠質瘤的局灶性壞死形成中至關重要，NF－κB活性的抑制或NF－κB調節基因被證明能促進腦腫瘤生長、發病和血管轉移［2－3］。NF－κB的異 常 激 活 表 達 與 多 種 疾 病 的 發 生 有 關［4－5］。研究表明，多種抗腫瘤藥物能引起NF－κB的活化［6］。吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）可抑制NF－κB的亞單位，并具有金屬螯合作用，是NF－κB特異性阻斷劑，可抑制其活性，具有多靶點高效的抗瘤作用。現將PDTC聯合卡鉑（carboplatin，CBP）對U251神經膠質瘤細胞增殖與凋亡的影響報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 U251神經膠質瘤細胞，達氏修正依氏培養基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），pH 7.2～7.4，10%胎牛血清（fetal bocine serum，FBS），四甲基偶氮唑藍（3－［4，5－dimethylthiazol－2－yl］－2，5diphenyl tetrazolium bromide，MTT），臺盼 藍染色，膜聯蛋白－V 型－異硫氰酸 熒光 素 （annexin－V－fluorescein isothiocyanate，annexin V－FITC）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙 染 色 試 劑 盒。PDTC，CBP，二 甲 基 亞 砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）。

1.2 方法

1.2.1 U251神經膠質瘤細胞培養與分組 U251神經膠質瘤細胞在100U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素和含有10%滅活FBS的高糖DMEM培養基中，置于37℃含5%CO2相對濕度95%的恒溫培養箱內培養細胞貼壁生長，每1天換液1次，2～3d以1∶3傳代1次，用0.125%胰蛋白酶消化傳代培養。將PDTC和CBP用無菌蒸餾水調整為20μg／mL，4℃冰箱避光冷藏。將傳代2次后的U251神經膠質瘤細胞隨機分4組，對照組加常規培養液，實驗A組加PDTC（0.1mg／mL）0.01mL，實驗B組加 CBP（1mg／mL）0.01mL，實驗 C組加PDTC（0.1mg／mL）0.01mL和CBP（1mg／mL）0.01mL，置于37℃、5%CO2、相對濕度95%的恒溫培養箱內培養。

表1 4組不同時間U251神經膠質瘤細胞生長抑制率和凋亡率比較（±s，%）

表1 4組不同時間U251神經膠質瘤細胞生長抑制率和凋亡率比較（±s，%）

＊：P＜0.05，與對照組比較；△：P＜0.05，與實驗C組比較。

組別細胞抑制率12h 24h 36h細胞凋亡率對照組 4.28±0.021△ 9.34±0.023△ 13.86±0.025△ 0.80±0.300△實驗A組 10.63±0.019＊△ 15.06±0.041＊△ 28.34±0.032＊△ 29.10±1.500＊△實驗B組 24.16±0.025＊△ 33.71±0.053＊△ 39.42±0.041＊△ 38.70±3.200＊△實驗C組 32.15±0.016＊ 40.82±0.046＊ 45.27±0.031＊ 61.30±2.700＊

圖1 顯微鏡下4組U251神經膠質瘤細胞形態（臺盼藍染色，×200）

1.2.2 U251神經膠質瘤細胞增殖情況觀察 采用MTT法生長抑制率（CGIR），抑制率越低，表示細胞增殖越高。將各組細胞懸液濃度調整為1×104／mL，加入96孔培養板中，每孔200μL，每組設3個平行孔。調零孔放對照組細胞懸液，對照孔分別放實驗A、B、C組的細胞懸液。繼續分別培養12、24、36h，每孔加入20μL MTT溶液，在培養箱內孵育4h后，終止培養，小心吸盡孔內上清液，每孔加入100μL DMSO，震蕩10 min，混勻后用酶聯免疫檢測儀檢測490nm波長處各組細胞的光密度值（optical density，OD），抑制率＝1－實驗組OD值／對照組OD值。

1.2.3 U251神經膠質瘤細胞凋亡率測算 采用流式細胞儀檢測按對照組和實驗A、B、C組置孔，每組設置6個復孔，取各組細胞，將細胞收入10mL離心管中，1 500r／min離心3 min，PBS液漂洗離心1次，棄去上清液。100μL PBS液沖懸細胞，輕輕吹勻成單細胞懸液。annexin－V－FITC、PI各加入5 μL，室溫避光染色30min，用流式細胞儀檢測，取每組6個數值，進行統計分析，得出每組細胞的凋亡率。

1.2.4 臺盼藍染色觀察 培養24h后從4個組中隨機各取1瓶培養瓶，用0.125%胰酶消化貼壁細胞，制備細胞懸液，并作適當稀釋。然后將購買的成品0.4%臺盼藍與細胞懸液以1∶9混合混勻（終濃度0.04%）。接著在3min內，倒置相關顯微鏡下觀察，死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件進行處理分析，計量資料以±s表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

4組U251神經膠質瘤細胞生長抑制率和凋亡率見表1。臺盼藍染色在倒置相關顯微鏡下細胞形態見圖1。

3 討 論

腦神經膠質瘤來源于神經上皮的腫瘤，是顱內最常見的惡性腫瘤，約占全部的顱內腫瘤的40%～50%。預后差，尤其是惡性腫瘤，平均生存期不超過1年。目前治療方法主要以手術切除為主，但由于其具有腫瘤浸潤性生長的特點，難以完全切除，術后復發率高，因此，常需要加以放療、化療及生物治療等輔助治療。NF－κB廣泛存在于機體細胞中，是一類能與多基因啟動子部位的κB位點特異結合并促進轉錄的DNA結合蛋白總稱。在靜止細胞中，由于IκB蛋白與 NF－κB結合，使NF－κB以無活性狀態存在于胞質中。當細胞受到外界刺激時，IκB蛋白可以被IκK激酶復合體磷酸化而導致降解，從而激活NF－κB，使NF－κB自由從胞質進入細胞核，與核內的靶序列結合，調控相關基因的轉錄，控制細胞增殖、死亡和遷移。NF－κB作為轉錄因子，通過上調一些促生存基因如Bcl－x l、TRAF 1、TRAF2、SOD等或凋亡蛋白抑制物的水平或直接誘導抗凋亡基因而發揮抗凋亡作用，可阻止由腫瘤壞死因子和其他遺傳毒性作用等引起的細胞凋亡［7］。有研究顯示，以腫瘤壞死因子誘導NF－κB的表達使乳腺癌細胞對放化療的抵抗力增加，姜黃素通過抑制 NF－κB而誘導凋亡［8－9］。有研究表明，在健康人腦組織細胞中僅存在無活化的NF－κB的表達，而在膠質瘤細胞中則可以檢測到活化的 NF－κB蛋白［1］。Xiong等［10］研究發現，抑制前列腺癌細胞中NF－κB的活性，可下調血管生成因子VEGF和IL－8，減少腫瘤血管形成，從而限制腫瘤的生長和轉移。最近，Lavon等［11］報道，在人腦膠質瘤細胞株中，NF－κB可以誘導O6－甲基鳥嘌呤－DNA甲基轉移酶蛋白的表達，導致細胞株對烷化劑耐藥。NF－κB在腫瘤細胞中有明確的抗凋亡作用，抑制NF－κB的表達可以增加腫瘤壞死因子引起的細胞凋亡及增加腫瘤細胞對放療、化療的敏感性［12－13］。人們已逐漸認識到NF－κB在腫瘤中所起的作用，NF－κB的抑制劑可成為惡性腫瘤治療潛在的靶點。亞硝脲類藥物是治療腦腫瘤的常用藥，CBP為第2代鉑類化合物，與順鉑同屬細胞周期非特異性藥物。由于抗腫瘤活性較強，消化道反應及腎毒性較低，因而是臨床治療各種實體腫瘤的常用藥。其主要作用DNA的鳥嘌呤的N7和O6原子上，引起DNA鏈間和鏈內交聯，破壞DNA分子，阻止其螺旋解鏈，干擾DNA合成，而產生細胞毒作用［14－15］。所以本實驗選用NF－κB抑制劑PDTC聯合卡鉑作用U251神經膠質瘤細胞。實驗結果表明，PDTC聯合卡鉑治療組較單一組治療細胞抑制作用增強，細胞凋亡率增高。這表明NF－κB抑制劑PDTC可以提高腫瘤細胞對卡鉑的敏感性，二者具有協同作用。其可能機制是NF－κB表達被特異性抑制后，NF－κB處于失活狀態，無法從胞質自由進入細胞核，與細胞核內的靶序列結合，就不能調控相關基因的轉錄、控制細胞增殖、死亡、遷移。并且NF－κB抑制劑PDTC還能抑制MGMT蛋白的表達，降低細胞株對化療藥物的耐藥性。

因此，NF－κB抑制劑PDTC聯合卡鉑可以抑制U251神經膠質瘤細胞的增殖并誘導其凋亡。聯合NF－κB抑制劑PDTC可以提高卡鉑對神經膠質瘤細胞的化療效果，抑制NF－κB活化為神經膠質瘤化療提供靶向，以期延長患者生命。

［1］ 唐萬忠，夏玉軍，孟慶海，等.NF－κB與腦膠質瘤的研究進展［J］.中國臨床神經外科雜志，2004，9（1）：79－81.

［2］ Xie TX，Aldape KD，Gong W，et al.Aberrant NF－κB activity is critical in focal necrosis formation of human glioblastoma by regulation of the expression of tissue factor［J］.Int J Oncol，2008，33（1）：5－15.

［3］ Atkinson GP，Nozell SE，Benveniste ET.NF－κB and STAT 3 signaling in glioma：targets for future therapies［J］.Expert Rev Neurother，2010，10（4）：575－586.

［4］ Wang H，Zhang W.Analysis of the activation status of Akt，NF－κB and Stat3in human difuse gliomas［J］.Lab Invest，2004，84（8）：941－951.

［5］ 劉玲.核轉錄因子的活化在腦缺氧缺血神經細胞凋亡中的調控作用及研究進展［J］.實用兒科臨床雜志，2003，18（6）：474－476.

［6］ Li Y，Ahmed F，Ali S，et al.Inactivation of nuclear factor kappa B by soy isoflavone genistein contributes to increased apoptosis induced by chemotherapeutic agents in human cancer cells［J］.Cancer Res，2005，65（15）：6934－6942.

［7］ Karin M，Cao Y，Greten FR，et al.NF－κB in cancer from innocent bystander to major culprit［J］.Nat ReV Cancer，2002，2（4）：301－310.

［8］ Braunstein S，Formenti SC，Schneider RJ.Acquisition of stable inducible up－regulation of nuclear factor－kappaB by tumor necrosis factor exposure confers increased radiation resistance without increased transformation in breast cancer cells［J］.Mol Cancer Res，2008，6（1）：78－88.

［9］ Freudlsperger C，Greten J，Schumacher U.Curcumin induces apoptosis in hunman neuroblastoma cells via inhibition of NF－kappaB［J］.Anticancer Res，2008，28（1A）：209－214.

［10］Xiong HQ，Abbruzzese JL，Lin E.NF－κB activity blckade impairs the angiogenic potential of human pancreatic cancer cells［J］.Int J Cancer，2004，108（2）：181－188.

［11］Lavon I，Fuchs D，Zrihan D，et al.Novel mechanism whereby nuclear factor kappaB mediates DNA damage repair through regulation of O （6）－methylguanine－DNA－methyltransferase［J］.Cancer Res，2007，67（18）：8952－8959.

［12］Hanefner B.NF－κB：arresting a major culprit in cancer［J］.Drug Discov Today，2002，7（12）：653－663.

［13］Duan L，Aoyagi M，Tamaki M，et al.Impairment of both apoptotic and cytoprotective signalings glioma cells resistant to the combine use of cisplatin and tumor necrosis factor alpha［J］.Clin Cancer Res，2004，10（1Pt 1）：234－243.

［14］Chang JK，Li CJ，Liao HJ，et al.Anti inflammatory drugs suppress proliferation and induce apoptosis through altering expressions of cell cycle regulators and pro－apoptotic factors in cultured human osteoblasts［J］.Toxicology，2009，25（8）：148－156.

［15］Carter DL，Asmar L，Barreea D，et al.Favorable survival observed after carboplatin，paclitaxel，and concurrent accelerated hyperfractionated radiotherapy for treatment of locally advanced head and neck carcinoma［J］.Invest New drugs，2008，26（5）：473－481.