miRNA－142－5p在特應性皮炎中的表達及其靶基因預測＊

肖能鑫，史丙俊，刁慶春，王修勇，蔣有讓，閆國富

（重慶市第一人民醫院皮膚病與性病科，重慶400011）

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種慢性復發性、瘙癢性、炎癥性皮膚疾病。多自嬰兒期起病，病情遷延反復。其病因及發病機制還未完全清楚，目前考慮為一種多基因病，涉及環境、基因及免疫之間的相互作用。近年來，一類新型微RNAs（microRNAs，miRNAs）分子在醫學學科的研究中備受關注，其為一類長度大約為20～25個核苷酸小分子RNA，分布廣泛。據推測，miRNAs可負反饋調節人類約1／3基因編碼的mRNA［1］。miRNA可通過兩種機制致使特定基因的沉默，對機體生長、發育及各種疾病尤其是腫瘤的發生和發展具有重要的調節功能。研究miRNA以及其生物學功能，特別研究其對腫瘤的負反饋調節的作用，是生命醫學研究的最新方向之一。近年來，運用基因芯片與高通量測序技術，已篩選出多種與疾病相關miRNA，證實了miRNA與人類重大疾病（如腫瘤、神經系統疾病、免疫性疾病等）的發生、發展存在相關性［2］。目前尚少有相關的文獻資料關于AD患者外周血單個核細胞（PBMC）中miRNA的研究。本研究初步探索AD患者PBMC中miRNA的變化，并進行生物信息學分析預測其靶基因，旨在為研究AD的分子調控機制提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年10月至2012年2月本院皮膚科門診AD患者8例（觀察組），其中男2例，女6例；年齡3～16歲，平均（8.0±3.8）歲。入選標準：（1）符合 Hanifin ＆ Rajka AD診斷標準；（2）3～16歲患者；（3）病程1年以上，每年緩解期小于3個月者。排除標準：血液常規及肝、腎功能檢查有嚴重異常的患者；患有傳染病、精神疾病、血液疾病、腫瘤、結締組織病、糖尿病、心臟病等系統疾病者；近1個月內系統使用糖皮質激素藥物或免疫抑制劑者。選擇同期年齡、性別與觀察組相匹配的健康體檢兒童6例為對照組。

1.2 方法

1.2.1 主要實驗試劑 miRcute miRNA提取分離試劑盒（離心柱型）、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒、miRNA－142－5P和has－U6檢測引物均購天根生化科技有限公司。

1.2.2 PBMC分離及miRNA的提取分離 Ficoll密度梯度離心法分離PBMC；miRNA的提取分離，按試劑盒操作說明書提取分離miRNA，而后進行純度和濃度的檢測。

1.2.3 逆轉錄合成miRNA cDNA第一鏈 首先進行miRNA 3′末端加尾處理，所得的Poly（A）反應液，取2μL配制cDNA反應體系進行下一步cDNA第一鏈合成，所得的cDNA第一鏈置－20℃保存。

1.2.4 實時熒光定量PCR（real－time PCR） 采用SYBR GreenI嵌合法，以U6為內參照進行實時熒光定量。本實驗采用逆轉錄產物10倍稀釋法建立標準曲線［3］，每種濃度設2個平行復孔。按照上述real－time PCR條件，對前期制備的各樣本的逆轉錄產物進行miRNA－142－5p檢測。每個miRNA做1次PCR，每個樣本均做3個平行復孔，取其平均值分析。

1.2.5 數據處理 首先計算所有標本miRNA－142－5p和U6的3個重復孔的平均CT值，將其作為每個樣本的實際CT值，將同一樣本miRNA－142－5p CT值減去其相應U6的CT值，獲得△CT值，在所有PBMC樣本的△CT值中選擇最大值△CT（max）作為衡量的標準，用其它樣本的△CT值減去△CT（max），得到每一個樣本的△△CT值，最后求得每一個樣本的相對表達量2－△△CT。

1.2.6 miRNA－142－5p靶基因預測 應用 miRanda、miRDB、PicTar、miRWalk、RNA22、Targetscan數據庫預測，選取至少5種計算方法均能預測到的基因作為其潛在靶基因。

1.3 統計學處理 數據采用SPSS17.0統計軟件包進行統計分析，所有數據均進行正態性檢驗。正態分布的計量資料以±s表示，相對表達量比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miRNA－142－5p real－time PCR擴增曲線及融解曲線 采用SYBR Green I嵌合法檢測 miRNA－142－5p的表達，在所有的樣本中均能得到良好的擴增。miRNA－142－5p和內參U6擴增效率基本一致（S值差絕對值小于0.1），可以用2－△△CT計算相對表達量。各樣本融解曲線呈單峰，說明擴增無二聚體形成，擴增產物單一，見圖1、2。

圖1 miRNA－142－5p擴增曲線

2.2 兩組PBMCs中miRNA－142－5p表達水平比較 miRNA－142－5p在觀察組患者PBMC中的相對表達量為（72.16±20.94），在對照組PBMC中的相對表達量為（18.79±13.19），AD患者的PBMCs中 miRNA－142－5p表達均上調，其表達水平與對照組比較，差異有統計學意義（P＝0.02）。

2.3 miRNA－142－5p靶基因預測 5或6個數據庫同時預測出靶基因數目為39個，其中包括：MAGI2、MARCH6、IGF2BP3、DCBLD2、CPEB2、ADPRH、ZNF569、SH3D19、HIPK1、CENTB2、SGMS1、SACS、HNRPH3、LRP2、MYCN、OTX2、PCDH9、PCTK2、LRP1B、ATG16L1、BTBD7、CXCR7等。結合GenBank數據庫得到相關靶基因的信息，它們參與細胞周期、信號轉導、細胞凋亡、細胞分化等各個方面的調控。

圖2 miRNA－142－5p融解曲線

3 討 論

miRNA己成為細胞生物學、基因遺傳學以及臨床學科等領域的研究熱點。其通過mRNA的降解或序列特異性抑制來調控基因表達，參與細胞發育、增殖、分化與凋亡等一系列的重要生物學進程［4］。miRNA參與正常免疫系統發育的調控［5］和慢性炎癥性疾病的發病過程［6］，機體細胞在接收到內源性或外源性信號后，miRNA可出現相應表達，其作為機體對內外環境變化后一種早期反應，參與了固有免疫應答過程。

miRNA－142位于人類17號染色體上，有2個亞單位：miRNA－142－3p和 miRNA－142－5p。成熟 miRNA－142－5p單鏈序列為：5′－CAUAAAGUAGAAAGCACUAC－3′。miRNA－142在造血干細胞的分化中具重要作用。miRNA－142－5p在T細胞中有明顯的表達，Wu等［7］用基因芯片技術檢測了初始T細胞、效應性T細胞和記憶性T細胞中miRNAs的表達，發現并證實了miRNA－142－5p等在效應性T細胞中表達下調，而在初始T細胞和記憶性T細胞中表達上調。Landgraf等［8］研究亦表明，miRNA－142在外周血CD8＋T細胞中表達上升。Annoni等［9］研究發現，miRNA－142可能通過調控抗原在抗原提呈細胞中的表達，誘導抗原特異性調節性T細胞的產生，從而使機體產生免疫耐受。Nakamachi等［10］研究發現，相對于骨性關節炎患者，miRNA－142在類風濕性關節炎患者的膠原纖維中表達上調。2010年，Sonkoly等［6］研究了AD患者皮損中miRNA的表達，發現與健康對照組相比，AD患者皮損中共有44個miRNA差異性表達，其中10個miRNA上調表達，包括miRNA－142－5p，miRNA－142－3p。本研究表明，與健康人相比，miRNA－142－5p在 AD患者PBMC中表達上調，與Sonkoly等［6］關于miRNA－142－5p在AD患者皮損的研究結果相一致。

目前關于miRNA－142－5p的相關報道較少，其在AD的發病過程的作用還不清楚。本研究通過生物信息學技術查找到miRNA－142－5p可與多個基因3′UTR相結合，下一步需要對其可能的靶基因進行實驗驗證，從而為AD的靶基因治療等提供新的依據。

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