促炎基因ALOX5AP多態性與腦卒中伴動脈粥樣硬化患者功能恢復的相關性

王建華 (唐山市工人醫院神經內科，河北 唐山 063000)

動脈粥樣硬化是導致腦卒中的重要因素，流行病學研究顯示了多種重要環境和遺傳危險因子如脂質代謝異常、高血壓、糖尿病、肥胖等均同動脈粥樣硬化相關聯〔1〕。炎癥作用是一個關鍵性的致病機制。國內關于腦卒中綜合危險度評估及干預方案的研究中發現5-脂氧酶激活蛋白基因變異對腦卒中伴動脈粥樣硬化有一定的影響。本研究現將針對促炎基因ALOX5AP多態性同腦卒中伴動脈粥樣硬化患者功能恢復的關系進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年5月至2009年12月我院收治的腦卒中患者78例。其中35例合并動脈粥樣硬化，43例單純腦卒中患者中男性26例，女性17例，年齡56～71〔平均(63.5±12.4)〕歲;合并動脈粥樣硬化患者中男性21例，女性15例，年齡58～72〔平均(61.2±15.3)〕歲。腦卒中入選標準:符合第四屆全國腦血管會議診斷標準，并經過CT/MRI確診為腦卒中，患者存在一定的運動功能障礙，但生命特征平穩。格拉斯哥昏迷評分＞8分，且為首次發病，首次發病后未見明顯功能障礙。動脈粥樣硬化病例入選標準:經冠狀動脈造影證實左前降支，左回旋支，右冠狀動脈中有至少1支內徑狹窄超過50%。病例排除標準:排除短暫性腦缺血發作、四肢癱瘓、病情惡化、蛛網膜下腔出血者、癡呆、合并嚴重肝腎心臟疾病、肌肉骨骼疾患、合并有活動性肝病、充血性心力衰竭、惡性腫瘤、呼吸功能衰竭的嚴重疾病者。兩組患者年齡，性別等基線資料進行比較結果顯示差異不具有統計學意義，表明兩組間具有可比性(P＞0.05)。

1.2 方法 采用聚合酶鏈反應限制性片段長度內切法檢測患者ALOX5AP基因2354T/A與16699A/G多態性。神經功能缺損評分(CNS)，FUGL-MEYER運動功能積分法(FMA)以及修訂巴氏指數(MBI)評價兩組患者的功能。運動功能:簡式Fugl-Meyer評分(FMA)。運動總分為100分，上肢運動最高分值66分，下肢運動最高分值34分。運動積分＜50分Ⅰ級，為嚴重運動障礙;50～84分為Ⅱ級，明顯運動功能障礙;85～95分為Ⅲ級，中度運動功能障礙;96～99分Ⅳ級，為輕度運動功能障礙。日常生活能力采用MBI。0～20分為極嚴重功能缺陷，25～45分嚴重功能缺陷，50～70分為中度功能缺陷，75～95分輕度功能缺陷。正常100分。ALOX5AP基因檢測方法:抽取兩組患者空腹12 h外周靜脈血，及時分離標本，4 h內完成測定。所有受試者于冠脈造影前動脈鞘管采血5 ml裝入EDTA抗凝管中30 min內離心，血漿血細胞分離。儲存于-70℃冰箱內。3個月內使用鹽析法提取全血基因組DNA。將抽血管血球帶倒入離心管后加溶液冰浴10 min，離心15 min，棄上清管內沉淀吹勻，加蛋白酶K，37℃過夜，再于管內加2.5 ml氯化鈉，至完全鹽析。離心15 min，去上清加氯仿混勻5 min，離心15 min吸出上清至50 ml離心管。上清液中加入無水乙醇，充分混勻DNA，挑出沉淀至1.5 ml離心管中，并加入75%乙醇洗兩遍，吸出乙醇溶液開蓋晾干，加入TE，于-70℃下保存。DNA提取后再進行5-脂氧合酶基因的擴增，限制性內切酶進行酶切兩基因點。

1.3 統計學方法 使用SPSS15.0統計軟件，計量資料使用±s表示，計數資料采用率的形式，計量資料的兩組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 兩組患者ALOX5AP基因頻率比較 ALOX5AP基因2354T/A，16699A/G于腦卒中合并動脈粥樣硬化組中呈高表達，顯著高于單純腦卒中組(P＜0.05)。見表1。

2.2 兩組患者功能評分 腦卒中合并動脈粥樣硬化患者的功能評分較單純腦卒中患者差(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組ALOX5AP等位基因頻率及神經功能評分(±s)

表1 兩組ALOX5AP等位基因頻率及神經功能評分(±s)

與腦卒中組比較:1)P＜0.05

43 12.4 8.3 17.34±8.04 31.52±6.34 29.11±6.23合并動脈粥樣硬化組 35 35.21) 24.81) 20.02±9.121) 27.53±6.671) 24.16±5.351)CNS MBI FMA單純腦卒中組組別 n 2354T/A等位基因頻率(%)16699A/G等位基因頻率(%)

3 討論

研究者在篩查5-LO抑制劑時發現了中性粒細胞中的白三烯合成的抑制劑，而MK-886于細胞裂解實驗中顯示5-LO并無抑制作用，對于酶的提純也無明顯抑制作用，使用親和柱MK-886放射光親和類似物法證明在大鼠及人白細胞中MK-886的分子可以同18 kD膜蛋白結合〔2〕。Dixon等〔3〕用人骨肉瘤細胞進行實驗研究，在單獨表達5-LO時發現僅在5-LO和18 kD蛋白功能表達的培養細胞中才可以合成白三烯。由此提示18 kD蛋白對于細胞內的5-LO活性是必需的物質，因此，將該類蛋白命名為花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白。

5-脂氧合酶是白三烯類代謝產物生成的關鍵酶，它催化花生四烯酸轉化為5-氫過氧化二十碳四烯酸進一步氧化成為白三烯，白三烯水化為白三烯B4或在其他酶類作用下催化生成LTC4參與炎性反應。其中LTB4是潛在中性白細胞、巨噬細胞以及其他炎癥細胞參與炎癥反應的化學誘導劑，它可以加速化學運動型增加血管內皮黏附是高活性物質。胱氨酰白三烯可以增加血管的通透性及平滑肌的收縮，它的多少也同支氣管和血管收縮、哮喘的發生有關〔4〕。5-脂氧合酶激活蛋白分子量為18 kD，其蛋白包含3個跨膜區與2個親水環，FLAP位于包膜或內質網上它是激活5-脂氧合酶活性所需。它是5脂氧合酶同膜的結合部位，除了可以參與5-脂氧合酶與膜的結合外也可以作為氨基酸合成蛋白的底物。

ALOX5AP基因于13號染色體 13Q12，基因長度約為31 kb，有5個較小的外顯子和4個內含子，該基因編碼區含有多核苷酸多態性，且其突變率較高，推測可能這些SNP中存在功能性突變，從而影響5-脂氧合酶激活蛋白的合成或影響其活性。既往有大量關于5-脂氧合酶激活蛋白調節5-脂氧合酶的活性，以及ALOX5AP基因變異對于5-脂氧合酶代謝途徑的影響。Helgado等〔5〕首先報道了ALOX5AP基因可以甲素白三烯的形成，刺激一些其他參與炎癥動脈硬化的路徑，并且確認ALOX5AP染色體的13q12-13位點可能是增加腦卒中患者發病危險的重要因素。雖然關于ALOX5AP報道的研究很多，但其變異同動脈粥樣硬化疾病的發生發展仍然缺乏相關研究。Helgado等〔5〕進一步研究發現，ALOX5AP，2354AA基因增加的人群中會增加1.55倍腦梗死的發病風險。但具體其同腦梗死發生的關聯機制并不明確。研究表明，FLAP/5-LO通道多于白細胞中表達，可以增加酶活性，促進炎性因子白三烯的釋放，增強血管通透性及血管的收縮以及單核細胞，血管內皮的黏附作用。如此，在斑塊的炎性損傷區域將存在一個惡性循環會增加血管損傷的風險性。ALOX5AP在多數研究中已經被證實可以通過致動脈粥樣硬化作用引發腦梗死，那么我們推測它在導致動脈粥樣硬化作用的發病過程中也起到一定作用。

本研究提示ALOX5AP基因的多態性和腦卒中合并動脈粥樣硬化患者的功能恢復具有一定的關聯，但本研究樣本量過少，相關的遺傳及環境也是影響試驗結果的重要因素，還需要進一步研究。

1 張偉麗，石 佳，楊曉敏，等.ALOX5AP基因多態2354T/A和MTHFR基因多態677C/T的協同作用顯著增加腦梗死的易患性〔J〕.中國分子心臟病學雜志，2005;5(1):395-400.

2 Ro M，Kim S，Pyun JA，et al.Association between arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein(ALOX5AP)and lung function in a Korean population〔J〕.Scand J Immunol，2012;76(2):151-7.

3 Dixon WP，McNeish JD，Griffiths RJ，et al.Induction of hepatic microsomal drug-metabolizing enzymes by inhibitors of 5-lipoxygenase(5-LO):studies in rats and 5-LO knockout mice〔J〕.Toxicol Sci，2001;63(1):15-21.

4 高 強，楊春曉，慕璐巖，等.ALOX5AP基因突變與缺血性腦卒中的關系〔J〕.臨床神經病學雜志，2007;20(5):326-8.

5 Helgado Lapenna A，Laxton RC，Ye S，et al.Comment on:a promoter polymorphism(rs17222919，-1316T/G)of ALOX5AP is associated with intracerebral hemorrhage in Korean population〔J〕.Prostagl Leukotr Essent Fatty Acids，2012;86(3):135-6.