羊肚菌液體發酵培養基成分及培養條件的優化

楊 建，張光宇，杜秀娟，楊玉紅*

（沈陽農業大學 生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110161）

羊肚菌屬于子囊菌亞門，是世界著名的野生食（藥）用菌，肉質脆嫩鮮美且藥用價值高，也是一種高級營養滋補品。因其表面有蜂窩狀的可孕頭部，外觀極似羊肚而得名[1-2]。羊肚菌富含蛋白質、氨基酸、多糖、維生素、多種礦物質及豐富的脂肪酸等，具有增強肌體免疫力、促進副腎皮激素的分泌、降低膽固醇、預防動脈硬化、抗疲勞、抗病毒、抑制肌癌-180等諸多作用，是一味良好的傳統中藥[3-8]。但是羊肚菌人工栽培存在著既要促使子實體原基形成，又要激發雙核化菌絲體形成的雙重困難，栽培難度很大[9]，所以至今仍不能進行羊肚菌子實體的大規模工業化生產。然而，研究發現，羊肚菌的菌絲體所含成分以及所具有的功效都與子實體相似，而且還能較好的保持子實體獨特的風味，適合液體培養[10]。液體發酵法生產食用菌的菌絲體要比栽培子實體簡便快速，許多目前還不能進行人工栽培的野生食用菌（如羊肚菌、牛肝菌、松菇、塊菌、雞油菌等）都可以用液體發酵法來生產菌絲體[11]。這樣一來，菌絲體發酵技術便成為解決資源問題的最佳途徑，給羊肚菌的產業化生產開辟了一條新路，而且液體發酵可以進行工業化的連續生產，具有規模大、菌絲體產量高、發酵周期短、生產效益高等優點[12]，所以液體菌絲體的發酵已成為當前研究的熱點，在食品、醫藥、保健、化妝品等領域顯示出極大的開發潛力[13-15]。

研究通過單因素和正交試驗，確定羊肚菌的最優液體培養基配方和最佳發酵工藝條件，對系統開發菌類產品、提高菌類產品的價值具有重要意義[16]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沈陽農業大學生物工程實驗室保存。

斜面培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨0.5g，牛肉膏0.5g，瓊脂20g，pH值自然，水1000mL。

種子液培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨0.5g，牛肉膏0.5g，pH值自然，水1000mL。

發酵培養基：葡萄糖25g，酵母膏25g，MgSO41g，KH2PO42g，VB12g，pH 6，水1000mL。

1.2 儀器與設備

LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海中安醫療器械廠；SW-CJ-ICU雙人單面凈化工作臺：浙江蘇凈凈化設備有限公司；HPX-9082 MBE數顯電熱培養箱：上海滬粵明科學儀器有限公司；BS-2F振蕩培養箱：常州邁科諾儀器有限公司；LXJ-68-02型離心機：上海醫分儀器制造有限公司；DZF-6090型真空干燥箱：上海雙旭電子有限公司。

1.3 試驗方法[17-25]

將馬鈴薯洗凈去皮后，切成小塊煮沸約30min，煮至熟而不爛為止，四層紗布過濾，再配以其他成分，加水定容，混合均勻，分裝在試管中，每只試管約10mL，在121℃滅菌30min，擺斜面放涼備用。將所有與接種有關的器具在超凈工作臺中通過紫外線殺菌30min后，在無菌環境下用接種環挑取于4℃保藏的羊肚菌菌種，轉接到新鮮的斜面培養基上，在28℃恒溫培養箱中培養5d～7d。

1.3.2 液體種子培養液的制備

按照種子液培養基配方制作培養基，分裝在250mL三角瓶中，滅菌。在無菌條件下，用接種環從斜面培養基上挑取羊肚菌菌絲體，接入裝有液體種子培養基的三角瓶中，置28℃恒溫搖床振蕩培養，轉速130r/min，培養5d得一級種子培養液。

1.3.3 液體發酵培養液的制備

準確稱取葡萄糖25g，酵母膏25g，MgSO41g，KH2PO42g，VB12g放入1000mL的燒杯中，加入500mL蒸餾水，加熱使其全部溶解，加水定容至1000mL，混合均勻，用量筒量取90mL發酵液倒入250mL三角瓶中滅菌。放涼后，放入超凈工作臺上并將所有與接種有關的器具通過紫外線殺菌30min。在無菌條件下，從種子培養液中吸取10mL的種子液加入發酵培養基中，置28℃恒溫搖床振蕩培養，轉速130r/min，培養7d。

1.3.4 發酵培養基成分及培養條件的單因素試驗

會上，國內外專家、果農示范戶等就蘋果新品種推廣及產業發展、以色列農業水肥一體化應用、白水蘋果種植及水肥一體化應用等內容進行了分享，諾貝豐推出的以“深海能”系列水溶肥產品為依托的蘋果種植全程營養解決方案更是受到了與會果農的廣泛關注和歡迎。同時，會上還舉辦了白水縣商務局、農機局為農村電商托管團隊、機械化作業服務團隊的授旗儀式，這標志著白水蘋果產業又實現了進一步深化發展。

（1）碳源篩選試驗：將液體發酵培養基中的碳源葡萄糖分別用等量（25g/L）可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麥芽糖替換，培養條件與發酵培養基培養條件相同，考察不同碳源對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

（2）氮源篩選試驗：將液體發酵培養基中的氮源酵母膏分別用等量（25g/L）蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀替換，培養條件與發酵培養基培養條件相同，考察不同氮源對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

（3）pH值篩選試驗：將液體發酵培養條件中的pH值分別調至4、5、6、7、8，培養基成分和其他培養條件與發酵培養基成分和培養條件相同，考察不同pH值對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

（4）溫度篩選試驗：將液體發酵培養條件中的發酵溫度分別調至22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，培養基成分和其他培養條件與發酵培養基成分和培養條件相同，考察不同發酵溫度對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

（5）搖床轉速篩選試驗：將液體發酵培養條件中的搖床轉速分別調至110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min，培養基成分和其他培養條件與發酵培養基成分和培養條件相同，考察不同轉速對羊肚菌菌絲體生物量的影響。

1.3.5 發酵培養基成分及培養條件優化的正交試驗設計

通過單因素試驗，每組選取3個水平作正交優化試驗設計。通過SPSS軟件的方差分析和比較，選取發酵培養基及培養條件的最適發酵配方和發酵條件。

1.3.6 測定方法及計算公式

取發酵液5000r/min離心10min，棄上清液，所得菌絲體用蒸餾水洗再離心，反復洗滌離心2～3次后，置于40℃干燥箱中烘干，并稱質量，計算出每200mL發酵液中的菌絲體生物量（g/200mL）。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基成分及培養條件單因素試驗

2.1.1 最適碳源的篩選

圖1 不同碳源對羊肚菌菌絲產量的影響Fig.1 Effect of carbon sources on yield ofMorchellamycelium

由圖1可知，羊肚菌菌絲在碳源為葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、果糖、蔗糖的發酵培養基中均能較好生長，但也存在著明顯差異，菌絲產量順序為蔗糖＞葡萄糖＞可溶性淀粉＞麥芽糖＞果糖，所以碳源選取蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉作正交試驗。

2.1.2 最適氮源的篩選

由圖2可知，羊肚菌菌絲在氮源為蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀酵母膏的發酵培養基中均能較好生長，但也存在著明顯差異，菌絲產量順序為牛肉膏＞酵母膏＞蛋白胨＞硝酸鉀＞硫酸銨，所以氮源選取蛋白胨、牛肉膏、酵母膏作正交試驗。

2.1.3 最適pH值的篩選

由圖3可知，羊肚菌菌絲在pH值為4的時候，菌絲不生長，而羊肚菌菌絲在pH值為5、6、7、8時均能生長，但也存在著明顯差異，菌絲產量順序為pH 6＞pH 7＞pH 8＞pH 5，所以pH值選取6、7、8作正交試驗。

圖2 不同氮源對羊肚菌菌絲產量的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on yield ofMorchellamycelium

圖3 不同pH值對羊肚菌菌絲產量的影響Fig.3 Effect of pH value on yield ofMorchellamycelium

2.1.4 最適溫度篩選

圖4 不同發酵溫度對羊肚菌菌絲產量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on yield ofMorchella mycelium

由圖4可知，羊肚菌菌絲在溫度為22℃、24℃、26℃、28℃、30℃的發酵條件下均能較好生長，但也存在著明顯差異，菌絲產量順序為28℃＞26℃＞24℃＞30℃＞22℃，所以發酵條件溫度選取24℃、26℃、28℃作正交試驗。

2.1.5 最適轉速篩選

由圖5可知，羊肚菌菌絲在搖床轉速分別為110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min的條件下均能較好生長，但也存在著明顯差異，菌絲產量順序為140r/min＞130r/min＞120r/min＞150r/min＞110r/min，所以發酵條件搖床轉速選取120r/min、130r/min、140r/min作正交試驗。

圖5 不同搖床轉數對羊肚菌菌絲產量的影響Fig.5 Effect of rotation shaker on yield ofMorchellamycelium

2.2 羊肚菌發酵培養基成分及培養條件優化的正交試驗

表1 發酵培養基成分及培養條件正交優化試驗設計Table 1 Design of orthogonal test for fermentation medium composition and optimization of cultivation conditions

表2 發酵培養基成分及培養條件正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test for fermentation medium composition and cultivation conditions

表3 發酵培養基成分及培養條件正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test result for fermentation medium composition and cultivation conditions

根據單因素試驗的結果，碳源選取蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉，氮源選取蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，再添加MgSO4、KH2PO4、VB1，發酵條件pH值選取6、7、8，溫度選取24℃、26℃、28℃，搖床轉速選取120r/min、130r/min、140r/min，進行3個水平5個因素的正交試驗設計（見表1），正交試驗的結果見表2，方差分析結果見表3。由表2和表3可知，不同組合之間菌絲生物量是不同的，各因素間的極差次序為氮源＞搖床轉速＞發酵溫度＞pH值＞碳源，極差越大，起的作用就越大，這說明氮源對生物量影響最大，搖床轉速次之，從菌絲體生物量來考察各因素水平值，A可取A2，B取B3，C取C2，D取D3，E取E3，因此選定最適合羊肚菌液體發酵培養基組合為A2B3C2D3E3，即可溶性淀粉2.5%，酵母膏2.5%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%，VB10.2%；最適培養條件pH值為7，發酵溫度為28℃、搖床轉速為140r/min，在最佳條件下所生產的菌絲生物量為3.438g/200mL。

3 結論

根據液體培養基的原則和方法，采用單因素試驗，優選出適合羊肚菌液體培養的碳源、氮源，發酵條件pH值、發酵溫度、搖床轉速。由羊肚菌液體發酵培養基及發酵條件的正交試驗可知，最適的發酵培養基成分和培養條件為：可溶性淀粉2.5%，酵母膏2.5%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%，VB10.2%；最適培養條件pH值為7，溫度為28℃、搖床頻率140r/min，培養7d，在最佳條件下所生產的菌絲生物量為3.438g/200mL。羊肚菌搖瓶液體發酵培養參數為今后開展發酵罐試驗，探索羊肚菌菌絲體規模化生產的工藝條件奠定了基礎。

[1]馬向東，陳紅歌.食用菌栽培新技術[M].開封：河南大學出版社，2002.

[2]陳向東，朱 戎，蘭 進.羊肚菌的研究進展[J].食用菌學報，2002，9（2）：56-61.

[3]張廣倫，張衛明，李 玉.羊肚菌的研究與利用[J].中國野生植物資源，1999，18（1）：1-3.

[4]宋淑敏，鄒作華，王洪蔭，等.EF-11營養液的研制及其保健作用的試驗研究[J].食品科學，1996，17（7）：52-57.

[5]CAVAZZONI V,ADAMI A,ARAGOZZINI F,et al.Meddpharm scientific[J].Publishers,1994(2):119-127.

[6]歐陽天贄，李小定，榮建華.真菌多糖抗腫瘤及免疫調節作用研究進展[J].天然產物研究與開發，2000，18（3）：524-528.

[7]趙桂云，馬慶斌.羊肚菌液體培養基配方的研究[J].食用菌，2002（6）：15-16.

[8]張 松，夏艷紅，姚珍平.羊肚菌菌絲生物學特性研究[J].食用菌學報，2002，9（1）：18-21.

[9]朱斗錫.羊肚菌工廠化栽培技術的探討[J].浙江食用菌，2010，18（1）：43-44.

[10]趙桂云，馬慶斌.羊肚菌液體培養基配方的研究[J].食用菌，2002（6）：15-16.

[11]朱玉昌，周大寨，唐巧玉，等.富硒野生食用菌液體培養條件初步優化[J].中國釀造，2009，28（4）：61-64.

[12]王 瑩，孫永海，王笑丹，等.粗柄羊肚菌菌絲液體培養條件的優化[J].食用菌，2007，29（6）：5-8.

[13]龍海正.羊肚菌的研究及其應用開發前景[J].中國生化藥物雜志，1997（3）：160-161.

[14]張廣倫，張衛明，李 皋.羊肚菌的研究與利用[J].中國野生植物資源，1999（1）：1-4.

[15]ROHE M,SCHRAGE K.Enhances macrophage activation from the edible fungusMorchella esculenta[J].J Agric Food Chem,2002,50(20):5683-5685.

[16]張旺壁，薛 莉.羊肚菌（Ydj0705）液體發酵工藝方法的研究[J].太原理工大學學報，2012（6）：660-664.

[17]李書蘭，和曉娜，李安利，等.不同配方培養基對羊肚菌菌絲生長及菌核和子實體形成的影響[J].安徽農業科學雜志，2012，40（5）：2587-2588，2593.

[18]何華奇，曹 暉，潘迎捷.大球蓋菇菌株形態學觀察[J].安徽技術師范學院學報，2003，17（4）：327-329.

[19]劉衛紅.羊肚菌液體菌種培養基配方優化研究[J].農業科技通訊，2011（11）：81-83.

[20]劉 勇，張長鎧，李昆峰.金針菇FV008深層發酵工藝的研究[J].食品與發酵工業，1998，24（3）：8-12

[21]秦俊哲，呂嘉析.食用菌貯藏保鮮與加工新技術[M].北京：化學工業出版社，2003.

[22]陶 熱，譚玉琴，陳 曄，等.小羊肚菌菌絲培養條件的研究[J].北方園藝，2011（47）：183-187

[23]楊 芳，王新鳳，李 剛.不同碳、氮源對羊肚菌生長與胞內多糖的影響[J].食品科學，2007，28（11）：386-400.

[24]陳易飛，郭益紅.溫度、pH對羊肚菌菌絲體生長的影響[J].蘇南科技開發，2007（8）：28-29.

[25]何華奇，曹 暉，潘迎捷.溫度和pH值對大球蓋菇菌絲生長的影響[J].安徽技術師范學院學報，2004，18（1）：42-45.