血管緊張素轉換酶基因多態性對早發冠心病血瘀證的影響1）

胡志希，胡思遠，李 琳，李 杰，凌 智，侯 超

冠心病（coronary heart disease，CHD）屬中醫“胸痹”范疇，究其病因有血瘀、痰阻、寒凝、氣滯之別，但其基本病機則是“心脈不通”，血瘀證是冠心病中最常見的證型之一［1－3］。如果CHD的發病年齡較輕（男性≤55歲，女性≤65歲）稱為早發CHD［4］。研究早發CHD血瘀證與血管緊張素轉換酶（ACE）基因多態性的相關關系以及對血管內皮功能的影響，明確早發CHD血瘀證的分子遺傳學特征，具有非常重要的意義。

1 資料與方法

1．1 診斷標準 符合1979年 WHO缺血性心臟病“心絞痛”、“心肌梗死”診斷標準，以患者臨床癥狀、體征和病史結合心電圖改變或冠脈造影（CAG）進行診斷。以男性≤55歲，女性≤65歲患有冠心病者為早發冠心病。

按照1995年《中華人民共和國中醫藥行業標準·中醫病證診斷標準》的辨證分型標準［5］；1997年《中華人民共和國國家標準·中醫臨床診療術語·證候部分》［6］；2002年國家中醫藥管理局醫政司胸痹急癥中國中醫藥學會內科學會心病專業委員會《中醫心病診斷療效標準與用藥規范》［7］。主癥：胸悶心痛，痛如針刺；兼癥：面色晦暗／口唇青紫／爪甲發青；舌象：舌質紫暗／舌有瘀斑；脈象：細澀／結代。主癥1項＋次癥2項＋舌脈1項，為心血瘀阻證。

1．2 納入標準 發病時年齡男性≤55歲，女性≤65歲；湖南地區出生；漢族；彼此無血緣關系。

1．3 排除標準 嚴重高血壓，糖尿病，惡性腫瘤，肝腎疾病、甲狀腺病患者。下列各種心臟病：糖尿病性心肌病、甲狀腺功能亢進性心臟病、高血壓性心臟病、肺源性心臟病、貧血性心臟病、系統性硬皮病性心臟病、風濕性心臟病。

1．4 研究對象 早發冠心病組選擇湖南中醫藥大學附一院、附二院的住院患者。早發CHD血瘀證組41例，男25例，女16例，年齡（57．21±4．15）歲；早發CHD非血瘀證組45例，男28例，女17例，年齡（58．58±4．09）歲。正常對照組38名，男21名，女17名，年齡（59．71±4．18）歲。經統計分析3組間性別、年齡比較無統計學意義（P＞0．05），具有可比性。

1．5 臨床指標檢測 采用南京建成生物工程研究所eNOS試劑盒（硝酸還原酶法）測定eNOS；采用北京普爾偉業生物科技有限公司血漿內皮素（ET）放射免疫藥盒（放射免疫分析法）測定。

1．6 DNA提取 參照《分子克隆實驗指南》［8］傳統酚抽提法提取血樣中的DNA。

1．7 DNA純度及濃度的確定 用移液槍吸取DNA溶液5μL至1．5mL EP管，用去離子水稀釋至80μL；用紫外分光光度計分別測量波長260nm及280nm時的OD值，確定DNA的純度和濃度；根據測得的DNA濃度將其稀釋成約80ng／μL。當OD1／OD2在1．7～2．0，表明提取的DNA符合要求。

1．8 聚合酶鏈反應引物擴增（PCR） ①引物設計參照Rigat［9］，引物1：5’－CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT－3’；引物2：5’－GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T－3’，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。②反應體系：2×Taq MasterMix1）25μL；引物1：1．5μL（37．5Pmol）；引物2：1．5μL（37．5Pmol）；模板：5μL；ddH2O：17μL；總體積：50μL；Taq酶：100 U／mL dNTPs 400Um MgCl24mol／L Reaction buffer。③反應參數：輕微搖勻，微量離心機離心后，加液狀石蠟20μL，放置PCR儀上，94℃變性4min，然后80℃以微量加樣器插入液狀石蠟油面下加入Taq酶2U。每個循環為94℃變性1min，58℃復性1min，72℃延伸1min 30s，共30個循環，72℃延伸10 min。循環完畢，取出PCR管，放置4℃待測。④PCR產物鑒定及分型：人類ACE基因包含26個外顯子及25個內含子，在16內含子中存在或缺失287bP的DNA片斷可導致插入（I）或缺失（D）的存在，DNA組也出現3種相應的ACE基因型，即ⅠⅠ、ID、DD［10］。若在190bP左右出現一條帶為DD型，在490bP出現一條帶為II型，同時具有190bP、490bP兩條帶為ID型。1．9 統計學處理 采用SPSS15．0統計軟件包分析。基因型及等位基因頻率采用頻數計算法。計量資料以均數±標準差±s）表示，兩組間均數比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗。計算比值比（OR）及95%可信區間（95%CI），檢驗水平a＝0．05。

2 結 果

2．1 各組臨床資料比較（見表1） 血瘀證組、非血瘀證組總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL－C）與正常對照組相比有統計學意義（P＜0．05），血瘀證組存在明顯的脂質代謝失常，這與以往的研究相符合。在發現的18例有冠心病家族史患者中，14例屬血瘀證，通過χ2檢驗，血瘀證組和非血瘀證有統計學意義（P＜0．05），血瘀證具有明顯的遺傳傾向。各組間性別、年齡、體重指數（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、血糖（BS）、高密度脂蛋白（HDL－C）均相近似（P＞0．05）。冠心病家族史早發冠心病血瘀證14例，早發冠心病非血瘀證4例。

表1 3組間各項臨床資料比較

2．2 ACE基因基因型及等位基因頻率分布 3組ACE基因型分布符合 Hardy－Weinberg平衡（P＞0．05），表明樣本來源于同一人群，具有一定代表性。其中在早發CHD血瘀證組：II基因型6例，ID基因型9例，DD基因型26例；早發CHD非血瘀證組：II基因型15例，ID基因型18例，DD基因型12例；正常對照組：II基因型23名，ID基因型11名，DD基因型4名。正常對照組、早發CHD血瘀證組、早發CHD非血瘀證組3組相比，ACE基因基因型及等位基因頻率分布有統計學意義（P＜0．05）。血瘀證組DD基因型及D等位基因頻率高于非血瘀證及正常對照組。而II基因型及I等位基因頻率明顯低于非血瘀證及正常對照組。非血瘀證組基因型分布與正常對照組相比有統計學意義（P＜0．05），但等位基因頻率與正常對照組相比無統計學意義（P＞0．05）。正常對照組與冠心病組相比，在基因型分布和等位基因頻率分布兩方面均有統計學意義（P＜0．05）。詳見表2。

表2 ACE基因I／D基因多態性基因型及等位基因頻率分布 例（%）

2．3 不同ACE基因型攜帶者發生早發CHD血瘀證的OR值

血瘀證患者與各組相比，DD基因型OR值均大于3，且95%CI區間不含1，表明DD型基因與早發CHD血瘀證發生關系密切，早發CHD患者DD型基因攜帶者易發生血瘀證。詳見表3。

2．4 三組ET、NO及ET／NO比較 早發CHD血瘀證組ET與早發CHD非血瘀證組、正常對照組有統計學意義（P＜0．05或P＜0．01），血瘀證明顯高于對照組和非血瘀證。NO測值各組之間相比無統計學意義。ET／NO以血瘀證最高，血瘀證與正常對照組相比有統計學意義（P＜0．01）。詳見表4。

表3 DD基因型攜帶者發生早發CHD血瘀證OR值

表4 三組NO、ET及ET／NO比較（±s）

表4 三組NO、ET及ET／NO比較（±s）

與正常對照組比較，1）P＜0．05；與正常對照組比較，2）P＜0．01；與非血瘀證組比較，3）P＜0．05

組別 n ET（pg／mL） NO（μmol／L） ET／NO早發CHD血瘀證組 41 71．15±17．182）3） 152．37±29．27 0．50±0．132）早發CHD非血瘀證組 45 66．34±12．341） 145．18±18．60 0．47±0．09正常對照組 38 54．49±8．06 155．29±25．24 0．38±0．08

2．5 3組不同ACE基因型的ET／NO比較 對124例受檢者各基因型間ET／NO分析結果表明，DD基因型ET／NO與ID、II基因型間相比均有統計學意義（P＜0．01），以DD基因型最高。三組間ET／NO值均以DD最高，其中以血瘀證最高。早發CHD血瘀證與正常對照組相比有統計學意義（P＜0．01），與非血瘀證組相比無統計學意義（P＞0．05），血瘀證ID基因型患者的ET／NO值與非心血瘀證組和正常對照者相比有統計學意義（P＜0．05）。詳見表5。

表5 3組不同ACE基因型的ET／NO比較（±s）

表5 3組不同ACE基因型的ET／NO比較（±s）

與CHD非心血瘀阻證組比較，1）P＜0．05；與正常對照組比較，2）P＜0．05，3）P＜0．01；與組內DD基因型比較，4）P＜0．01

組別 II n ET／NO ID n ET／NO DD n ET／NO早發CHD血瘀證組 6 0．53±0．234） 9 0．59±0．121）2）4） 26 0．68±0．153）早發CHD與非血瘀證組 15 0．51±0．274） 18 0．55±0．14 12 0．66±0．19正常對照組 23 0．50±0．18 11 0．50±0．25 4 0．59±0．13全體受檢者 44 0．52±0．20 38 0．55±0．19 42 0．61±0．28

3 討 論

3．1 ACE基因多態性與早發CHD的關系 人類的ACE基因屬單拷貝基因，定位于染色體17q23上，長21Kb，由26個外顯子和25個內含子組成。近年來發現人類ACE基因存在插入／缺失多態性，即以其第16內含子中一長為287bp的Alu片段的有無為標志，分為插入（I）和缺失（D）兩種等位基因和DD型（純合子）、II型（純合子）和ID型（雜合子）三種基因型。本項研究表明，早發CHD患者DD基因型及D等位基因頻率明顯高于正常對照組，與文獻報道一致［11－13］，且 DD基因型OR 值為14．73（χ2＝23．42，95%CI為4．37～49．68，P＜0．01），說明 DD基因型可能與早發冠心病發生相關。

3．2 ACE基因I／D多態性與血清ACE、ET／NO的關系 以血漿ET與NO比值作為內皮細胞功能指標對二者關系進行了探討，結果表明ET／NO比值DD型比II型明顯升高（P＜0．05）［14］。ACE DD基因型患者 ET／NO 比值升高，認為這是ACE引起冠脈痙攣的另一重要作用機制［15］。本項研究發現，早發CHD血瘀證組、早發CHD非血瘀證組與正常對照組相比，血中ET、ET／NO相比均有統計學意義（P＜0．05），早發CHD血瘀證患者血漿ET含量明顯升高，NO血清含量無統計學意義。通過對各組不同基因型ET／NO綜合分析表明，在整個觀察對象中以DD型ET／NO最高，各組之間也均以DD型ET／NO比值最高。且血瘀組DD基因型NO／ET明顯高于非血瘀組、正常對照組，進一步說明早發CHD血瘀證的發病可能與ACE基因多態性分布密切相關。

3．3 早發CHD血瘀證與ACE基因多態性分布的關系 ACE基因I／D多態性與冠脈病變嚴重程度相關，且DD及D等位基因的頻率隨冠脈病變程度的加重而升高［16］。本項研究結果顯示正常對照組、早發CHD非血瘀證組、早發CHD血瘀證組中的D等位基因頻率分別為19%、42%、61%，DD基因型比例分別為4%、12%、26%，呈逐漸增高趨勢，三組相比DD型基因及D等位頻率有統計學意義（P＜0．01）。血瘀證組DD型基因及D等位頻率明顯高于非血瘀證組（OR＝4．76，95%CI：1．90～11．92，P＜0．01）及正常對照組（OR＝14．73，95%CI：4．37～4 9．68，P＜0．01），與整個觀察對象相比有統計學意義（OR＝3．38，95%CI：1．62～7．07，P＜0．01）。DD型等位基因可能為早發CHD血瘀證候選的標志基因，但尚需進一步擴大樣本數進行驗證。同時尚需進一步進行血瘀證家系遺傳學研究加以證實。

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