丹參注射液對急性腦梗死大鼠腦組織VEGF表達的影響1）

趙 寧，陸 琳，楊萬章，林 慧，王碧涵

急性腦梗死（ACI）往往導致患者運動、感覺、語言、認知、吞咽及精神情感障礙。神經系統及腦血管損傷后，神經營養因子的表達會發生改變，這些改變與血管及神經系統的可塑性之間有重要關系。血管內皮生長因子（VEGF）作為血管發生的神經營養因子，是促進血管新生、重建微循環所必須，亦同樣具有神經保護和神經再生作用［1］。本研究用具有活血化瘀作用的丹參注射液腹腔注射，從改善ACI后微環境著手，觀察與血管神經重塑密切相關的VEGF表達和神經功能缺損評分的變化，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 選取健康成年雄性SD大鼠60只（廣州中醫藥大學實驗動物中心提供），8周齡，體重250g～300g。飼養于正常晝夜環境中，給予標準飼料及飲水。

1．2 腦梗死大鼠模型的制備 大鼠麻醉固定。鈍性分離胸骨舌骨肌、胸骨鎖骨肌、肩胛舌骨肌。鏡下分離暴露左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），結扎頸內動脈的分支翼腭動脈（PPA）。電凝ECA的分支－枕動脈、甲狀腺上動脈、咽升動脈、上頜外動脈，結扎并游離ECA的主干。在ECA殘端剪一0．2mm的小口，將線栓插入，為防止尼龍線滑出和出血，將頸外動脈的備用絲線系緊 ，然后松開ICA和CCA處的活結。拉動ECA殘端，使ECA與ICA成一條直線，將線栓向ICA插入，待線拴頭端通過ICA與PPA分叉處后，松開PPA處的活結。繼續將線栓插入大腦前動脈近端，此時線栓插入深度為（18．5±0．5）mm，并在ICA與PPA分叉處扎緊ICA，分層縫合皮膚。把大鼠放在復蘇盒內，待大鼠清醒后單獨飼養，自由攝取水和食物。

1．3 入選標準 大鼠手術后12h根據Zeal Longa的5分制評分標準進行神經功能學評分，1分～3分大鼠入選，成功模型選入實驗研究。

1．4 分組及給藥 入選大鼠先按給藥的方式分為3組：A、B及C組。A組：丹參注射液組；B組：對照組；C組：假手術組，每組12只。從造模成功至實驗取材期間每日腹腔注射丹參注射液，0．5mL／次，1次／日，臨床用量：30g生藥／20（mL·d）。丹參注射液臨床等效劑量＝30g生藥／日×0．018×5＝2．7g生藥／（kg·d）或2mL／（kg·d）。按大鼠體表面積折算丹參注射液等效劑量：250g～300g大鼠的中劑量為0．5mL／d～0．6 mL／d，大劑量為1mL／d～1．2mL／d，小劑量為0．25mL／d～0．3mL／d，此研究中使用中劑量，按分組方案執行使用療程。丹參注射液組：從造模成功開始連續使用丹參注射液腹腔注射，0．5mL／次，1次／日，連用7d。模型對照組：從造模成功開始連續使用與丹參注射液等劑量的生理鹽水，連用7d。假手術組：大鼠入選后不予用藥。

1．5 檢測指標

1．5．1 神經功能損傷程度評分（NSS） 造模完成后1d、3d及7d評分。評分范圍0～18分，分數越高表明大鼠的神經功能缺損越重。

1．5．2 腦組織VEGF表達 ELISA法檢測：加入100μL配制好的每個標準品和樣品到反應孔中，用覆膜蓋好并37℃溫育2 h。棄去孔內液體。每孔加檢測液A 100μL，晃勻后加上覆膜，37℃溫育60min。棄去孔內液體并用稀釋好的洗滌液洗板3次。每孔加檢測液B 100μL，37℃溫育60min。加入90μL底物到每個反應孔。避光，37℃溫育30min。加入50μL終止液到每個反應孔中，立即用酶標儀在450nm波長下依序測量各孔的光密度（OD值）。根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數，即為腦組織VEGF濃度。

1．6 統計學處理 采用SPSS18．0統計軟件，對數據資料進行正態分布檢驗，符合正態分布多組資料采用單因素方差分析，兩組資料采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布者進行數據轉化后比較，結果以均數±標準差（±s）表示。

2 結 果

2．1 3組大鼠神經功能評分 在腦梗死后，丹參注射液組和對照組表現出一致性變化趨勢，均有下降趨勢，假手術組基本無變化，只作為正常對照，不做特殊討論。丹參注射液組在3d、7d兩個時間點與對照組比較，NSS評分有明顯下降（P＜0．01），丹參注射液腹腔注射后能從行為學上改善大鼠的神經功能。詳見表1。

表1 3組大鼠神經功能評分（±s） 分

表1 3組大鼠神經功能評分（±s） 分

與對照組比較，1）P＜0．01；與假手術組比較，2）P＜0．01

組別 n 1d 3d 7d丹參注射液組 12 9．25±2．05 4．67±1．831）2） 4．08±1．881）2）對照組 12 9．33±2．70 7．91±2．022）3） 7．75±1．542）假手術組 12 0 0 0

2．2 3組大鼠治療后VEGF表達 在腦梗死后，3組VEGF表達呈現不一致性變化趨勢，丹參注射液組在3d及7dVEGF濃度高于對照組及假手術組，血液中VEGF濃度太低，無法測定。丹參注射液組與對照組比較，腦組織VEGF有增高趨勢，提示丹參注射液可上調ACI后VEGF的表達（P＜0．05）；丹參注射液組與假手術組比較，腦組織VEGF有增高（P＜0．05）；對照組與假手術組比較，對照組VEGF有增高趨勢，表明ACI后，腦組織VEGF會應激性增高（P＜0．05）；丹參注射液3d和7d兩個時間點相比，VEGF表達，差異無統計學意義。丹參注射液能延緩ACI后VEGF下調的時間，持續刺激VEGF的高表達，對于促進神經及血管的修復有積極的意義。詳見表2。

表2 3組腦組織VEGF表達（±s） pg／mL

表2 3組腦組織VEGF表達（±s） pg／mL

與對照組比較，1）P＜0．05；與假手術組比較，2）P＜0．05

組別 n 3d 7d丹參注射液組 12 230．34±59．391）2） 264．30±55．911）對照組 12 179．73±35．282） 194．24±30．92假手術組 12 142．19±28．56 142．19±28．56

3 討 論

急性腦梗死后神經功能缺損的本質是中樞神經細胞的壞死，一般認為中樞神經細胞是終末分化細胞，缺乏再生能力。腦梗死后，除損傷區域的神經組織直接受損外，由此導致的繼發性動力性損傷也很重要。祖國醫學認為急性腦梗死屬于“中風”的范疇，無論從病因病機分析，都存在“瘀血阻絡”的因素，因此活血通絡對于急性腦梗死的治療尤為重要。而丹參注射液的作用主要著眼于“活血化瘀”這個環節，這也為本實驗提供了客觀的理論依據。

既往的研究已證實，VEGF是一種多效性血管生長因子，具有促進內皮細胞增殖，提高血管通透性等生物學特性，在缺血的腦組織中對于神經血管重塑發揮著至關重要的作用。一方面VEGF能夠促進血管內皮細胞分裂增生遷移、增強毛細血管的通透性、增加腦血流［2］、具有強效的抗炎、抗凋亡［3］以及免疫抑制特性的作用［4］；另一方面VEGF及其受體還是一種獨立的神經保護因子，對神經元及神經膠質細胞有保護效應［5］，可以增強神經前體細胞的募集及增殖作用，能夠直接促進損傷后的大腦皮層神經元再生、突觸重塑以及健側皮質延髓束長距離軸突的再生［6］。因此，VEGF的血管修復性、親神經性及神經細胞保護性，成為聯系血管生成和神經再生中最重要的“樞紐”。

丹參為唇形科植物，味苦，性微寒。具有活血祛瘀、養血安神、調經止痛、涼血消癰的功效。丹參的有效成分主要分為脂溶性和水溶性兩大類。丹參注射液屬于水溶性藥物，以酚性酸類化合物為主。藥理研究表明丹參注射液中的單體成分丹酚酸B可促進內皮細胞分泌某些細胞因子，并促進毛細血管的形成［7］，丹酚酸B的代謝產物SMND－309可通過激活EPO受體／STAT3信號通路上調VEGF的表達促進血管的發生［8］，丹參注射液中其他單體成分如丹參酮、丹參素均能促進干細胞向神經元巢蛋白及絲蛋白方向分化［9，10］，分化過程中可產生與細胞生長相關的神經營養因子，如VEGF、IGF及BFGF等，這些細胞因子可通過自分泌或旁分泌的方式，刺激局部血管和神經元細胞的增生，抑制缺血區神經元細胞凋亡，在改善神經缺損功能方面起著十分重要的作用。另外，丹參注射液自身還能促進心肌梗死大鼠缺血心肌VEGF、BFGF及PDGF－B蛋白的表達［11］，發揮促血管新生及腦保護的作用。

本實驗丹參注射液組中大鼠腦組織VEGF在3d和7d兩個時間點均呈高表達、NSS評分下調，與對照組、模型組比較有統計學意義，丹參注射液在急性腦梗死大鼠模型中，可促進大鼠腦組織中VEGF的分泌，改善大鼠神經行為學的功能，丹參注射液可通過上調VEGF的水平，優化局部的微環境，而局部VEGF的持續增多，又可能特異性作用于血管內皮細胞、神經細胞（包括神經元、星型膠質細胞及少突膠質細胞）促進血管及神經的共同修復［1］，對于加強血管發生及神經重塑的聯系有積極作用，具有進一步的研究價值。

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