壯通飲對(duì)大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化作用的研究1）

陳曉鋒，王婧婧，陸 惠

干細(xì)胞是機(jī)體在發(fā)展適應(yīng)過(guò)程中保留的一部分未分化的原始細(xì)胞，是具有全部或部分分化能力的細(xì)胞，在一定條件下這些干細(xì)胞可以增殖和分化成多種功能的細(xì)胞或組織器官。內(nèi)源性干細(xì)胞（neural stem cells，NSC）是來(lái)自機(jī)體本身的干細(xì)胞，是儲(chǔ)備在人體內(nèi)的巨大修復(fù)潛力的干細(xì)胞，側(cè)腦室壁的室管膜下區(qū)和海馬齒狀回的顆粒下區(qū)是內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞主要集中區(qū)域［1］。內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在一定條件下可以分化產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞［2］。壯通飲作為臨床治療腦梗死的壯醫(yī)藥經(jīng)驗(yàn)方，主要由扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮三味特色壯藥配伍而成。扶芳藤及參三七有促進(jìn)干細(xì)胞增殖作用，但這些都是拘于對(duì)該方中單味藥進(jìn)行的研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)壯通飲對(duì)誘導(dǎo)新生大鼠海馬NSC分化過(guò)程的研究，闡明壯通飲促進(jìn)神經(jīng)再生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生 Wistar大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1．2 主要試劑 一抗為鼠抗巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)元核心抗原（NeuN）和髓鞘堿性蛋白（MBP）單克隆抗體以及膠原纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體（Sigma）；ABC試劑盒、FITC羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1．3 藥物制備 壯通飲：扶芳藤30g，三七10g，黃花倒水蓮25g。藥材去除雜質(zhì)切制后，按組方劑量配比，加入生藥材10倍量的水，浸泡60min后，用TC－15套式恒溫器250V電壓加熱煎煮。沸騰后將電壓調(diào)低至150V，保持微沸狀態(tài)煎煮1h，濾取煎液。藥渣再加入生藥材8倍量的水，同法煎煮1h，濾取煎液。合并兩次煎液，于恒溫水浴鍋（100℃）蒸發(fā)去水分至濃稠狀，轉(zhuǎn)入恒溫烘箱（60℃）干燥，得干浸膏，稱(chēng)重，收膏率為36．80%，4℃保存，備用。臨用前使用蒸餾水溶解浸膏至生藥材含量為2．0g／mL。

1．4方法

1．4．1 原代培養(yǎng) 取新生當(dāng)天 Wistar大鼠，乙醇消毒后斷頭取腦，取雙側(cè)大腦海馬區(qū)于D－Hanks液中，剝離出腦膜及血管，用眼科剪剪碎成糊狀，加DMEM／F12培養(yǎng)液（Hyclone），用細(xì)口吸管機(jī)械吹打，200目金屬濾網(wǎng)過(guò)濾后獲得單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以5×105／mL的細(xì)胞濃度接種到培養(yǎng)瓶中，加入2%B27、終濃度為20ng／mL的EGF和bFGF（均為Gibco產(chǎn)品）后置37℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)每3d～4d進(jìn)行半量補(bǔ)液。培養(yǎng)7d～9d后，機(jī)械分離神經(jīng)球進(jìn)行傳代［3］。

1．4．2 傳代培養(yǎng) 將原代培養(yǎng)7d～9d形成的神經(jīng)球（50～200個(gè)細(xì)胞／球）懸液移至離心管，低速離心后吸棄上清液，機(jī)械吹打制成單細(xì)胞懸液后，再以5×105／mL細(xì)胞密度接種培養(yǎng)。以后每6d～8d傳代1次［4］。

1．4．3 神經(jīng)干細(xì)胞分化及壯通飲誘導(dǎo)作用 培養(yǎng)的第2代神經(jīng)球收集，以約2×105／mL的細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板各孔中。孔底放置預(yù)先用100mg／L多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的蓋玻片，每塊培養(yǎng)板分對(duì)照組和20mg／L、40mg／L、80mg／L壯通飲組，每組6孔。對(duì)照組培養(yǎng)液為原有培養(yǎng)液去除bFGF及EGF，另加10%胎牛血清（FBS）配制。壯通飲組培養(yǎng)液是在對(duì)照組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入壯通飲，濃度分別為20mg／L、40mg／L和80 mg／L。將培養(yǎng)板置飽和濕度、37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1．4．4 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定 以神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin鑒定增殖期NSC，并檢測(cè)各組分化培養(yǎng)7d時(shí)Nestin以及NeuN、GFAP和MBP（分別為神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)情況。取出24孔培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片，以4%多聚甲醛固定后，0．01mol／L PBS沖洗。檢測(cè)Nestin用免疫熒光方法，加一抗37℃孵育60min，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗孵育30 min，甘油緩沖液封片后熒光顯微鏡下觀察。余采用免疫細(xì)胞化學(xué)ABC改良法。DAB或BCIP／NBT顯色，著棕黃色或紫藍(lán)色的細(xì)胞為陽(yáng)性。其中小鼠抗NeuN及兔抗GFAP為1∶500、小鼠抗MBP為1∶200。Olympus倒置顯微鏡及普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。在200倍數(shù)下，每個(gè)蓋玻片上隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2．1 NSC的體外原代及傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)1d細(xì)胞呈圓形亮點(diǎn)，2d～3d可見(jiàn)有數(shù)個(gè)細(xì)胞形成的啞鈴樣結(jié)構(gòu)，4d～5d可以見(jiàn)到幾十個(gè)細(xì)胞形成的神經(jīng)細(xì)胞球（neurosphere），6d可見(jiàn)神經(jīng)球明顯增大，直徑達(dá)100μm～150μm，8d～10d大的神經(jīng)球直徑已達(dá)到150μm～200μm。原代及多次傳代培養(yǎng)（目前在本實(shí)驗(yàn)室條件下已傳10代）形成克隆球的細(xì)胞圓潤(rùn)飽滿，邊界清晰，活力狀態(tài)佳，經(jīng)鑒定Nestin表達(dá)陽(yáng)性。

2．2 壯通飲對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響 在去除bFGF及EGF，加10%胎牛血清配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后，神經(jīng)干細(xì)胞部分分化為NeuN染色陽(yáng)性的神經(jīng)元、GFAP染色陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和MBP染色陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞。NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元的胞體呈圓形或錐體形，有較長(zhǎng)軸突。GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體稍小，胞突長(zhǎng)而直，分支較少。MBP陽(yáng)性少突膠質(zhì)細(xì)胞的胞體更小，呈扁平狀，突起比神經(jīng)元樣細(xì)胞和星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的少。添加壯通飲培養(yǎng)7d后表達(dá)Nestin抗原的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加（P＜0．05），而且表達(dá) NeuN （P＜0．05）、GFAP及MBP的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組也明顯增多（P＜0．01）。隨壯通飲濃度增加NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多（P＜0．01），但GFAP及MBP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)壯通飲各劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1 壯通飲對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用（±s）

表1 壯通飲對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用（±s）

與對(duì)照組比較，1）P＜0．05；與其他劑量壯通飲組比較，2）P＜0．05

組別Nestin NeuN GFAP MBP對(duì)照組16．7±1．5 17．1±1．7 22．4±2．4 5．9±1．4 20mg／L壯通飲組 20．2±1．41） 20．3±1．91） 28．2±3．71） 8．1±2．31）40mg／L壯通飲組 23．6±1．91） 24．5±2．81）2） 28．8±4．01） 8．5±2．61）80mg／L壯通飲組 32．8±2．21） 28．2±3．61） 30．1±3．61） 8．9±3．21）

3 討 論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［5］，在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在NSC，主要分布在海馬、紋狀體、腦室下區(qū)、嗅球以及發(fā)育過(guò)程中的大腦皮質(zhì)和脊髓。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)從新生大鼠大腦海馬中分離、培養(yǎng)成細(xì)胞懸浮球，經(jīng)鑒定呈Nestin陽(yáng)性。Nestin［6－8］即巢蛋白，又名神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白，屬于中間絲蛋白，主要在神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)一過(guò)性表達(dá)，當(dāng)干細(xì)胞向著終末細(xì)胞分化完成后，其表達(dá)停止，成熟細(xì)胞有著特異的表達(dá)標(biāo)志物，所以巢蛋白被廣泛用于神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物質(zhì)，Nestin陽(yáng)性表明為神經(jīng)干細(xì)胞分化。

體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞與其所處微環(huán)境關(guān)系密切，其中主要因素就是培養(yǎng)基質(zhì)中的各種細(xì)胞因子，這些因子的成分和濃度能決定神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及其分化方向［9，10］。因此，利用某種藥物對(duì)體外神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)增殖和分化，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的治療帶來(lái)了新的希望。壯通飲中的扶芳藤對(duì)小鼠外周血造血干細(xì)胞有明顯的動(dòng)員作用，并具有作為有效干細(xì)胞動(dòng)員劑的潛力［11］；三七總皂甙可以提高腦梗死患者骨髓干細(xì)胞動(dòng)員率［12］；三七總皂甙能夠促進(jìn)新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化，有促進(jìn)干細(xì)胞增殖的作用［13］，但這些都是拘于對(duì)該方中單味藥進(jìn)行研究，壯通飲是否能夠誘導(dǎo)大腦海馬區(qū)NSC增殖分化，迄今缺乏明確的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在NSC分化期，添加壯通飲后，表達(dá)Nestin抗原的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加，同時(shí)表達(dá)NeuN、GFAP和MBP的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多。其中NeuN（神經(jīng)元核心抗原）在神經(jīng)元分化成熟后開(kāi)始表達(dá)，是成熟神經(jīng)元的特殊標(biāo)志物［14，15］；膠原纖維酸性蛋白是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物［16］；髓鞘堿性蛋白是少突膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物［17］。壯通飲能夠促進(jìn)新生大鼠大腦海馬NSC的分化和增殖。在相同接種密度下對(duì)比三種不同劑量壯通飲組分化產(chǎn)生的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，可以看出在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，壯通飲濃度越大，分化形成的神經(jīng)元細(xì)胞越多，而壯通飲對(duì)NSC分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞雖有促進(jìn)作用，但與其濃度的關(guān)系不大。提示壯通飲對(duì)NSC尚具有一定的定向誘導(dǎo)分化作用。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，壯通飲能誘導(dǎo)大腦海馬區(qū)NSC分化，具有一定的促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。

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