大氣壓冷等離子體射流滅活子宮頸癌Hela細胞*

黃駿 陳維 李輝 王鵬業 楊思澤2)

1 引言

近幾年來,大氣壓冷等離子體射流及其在生物醫學方面的應用研究正獲得越來越多的關注[1-15],尤其癌癥治療這個醫學難題已成為等離子體醫學領域一個持續的研究熱點.子宮頸癌是嚴重危害全球婦女健康的主要惡性腫瘤之一[16],發病率僅次于乳腺癌,高居婦女惡性腫瘤的第二位,每年全世界約有50萬新發病例,將近29萬死亡病例[17].其中,約80%的宮頸癌患者在發展中國家[18].我國是子宮頸癌的高發區,每年新發病例約占全球新發病例總數的1/3[19],其中約有3萬人死于宮頸癌[20].目前,子宮頸癌常規的治療方式中,外科手術雖然是一種有效措施,但絕大多數患者就診時已是中晚期,化療成為最主要的治療手段,雖然在一定程度上能提高宮頸癌患者的緩解率[21],但其不具有針對性,在殺滅惡性腫瘤細胞的同時,也會無選擇性地損害大量正常細胞,對機體產生較大的毒副作用和耐藥性,導致仍有部分患者臨床療效難盡人意.而利用大氣壓冷等離子體射流滅活癌細胞具有相對靶向性強、操作靈活、療效確切、毒副作用小等優點,使其在癌癥治療的道路上成為一種潛在的新方法.本文研究了大氣壓冷等離子體射流對子宮頸癌細胞的滅活作用,探討了活性氣體氧氣在惰性氣體氬氣中的百分含量對Hela癌細胞滅活效率的影響,并揭示了大氣壓冷等離子體射流對Hela癌細胞的滅活機制.

2 實驗

2.1 裝置

本文使用的大氣壓冷等離子體射流裝置的結構,如圖1所示.等離子體射流裝置主要由兩個電極、聚四氟乙烯固定器、石英管(內徑6 mm,外徑8 mm)和橡皮塞組成.一根不銹鋼細管(內徑0.9 mm,外徑1.6 mm)作為內電極與電源高壓端相連,被橡皮塞和聚四氟乙烯固定器固定在石英管的中心.銅箔(寬度5 mm)作為外電極與地線連接,包裹在石英管下部漏斗型噴嘴處(內徑從6 mm到1 mm),銅箔下端距離管口5 mm.工作氣體氬氣從石英管側壁通入,而活性氣體氧氣從不銹鋼細管頂端注入.如圖2所示,為大氣壓冷等離子體射流處理Hela癌細胞的實物圖.用峰值電壓為30 kV,頻率變化范圍在8—40 kHz的交流電源(CTP2000)產生等離子體射流,作用于接種在96孔板底部的Hela細胞.

圖1 大氣壓冷等離子體射流裝置結構示意圖

圖2 大氣壓冷等離子體射流處理Hela癌細胞的實物圖

2.2 樣品制備

將Hela細胞用含10%胎牛清和密理博高糖培養基(DMEM)在37°C,5%CO2條件下培養,待細胞生長至近融合狀態,消化細胞,將細胞濃度調整為4000個/孔,把培養好的Hela細胞株接種到微量滴定96孔板中,隨后加入2 mm厚度DMEM繼續培養待細胞完全貼壁后進行等離子體處理.

2.3 實驗方法

對培養后的子宮頸癌Hela細胞株樣品先進行等離子體處理,隨后利用中性紅檢測其活性.實驗前打開紫外燈滅菌20—30 min.處理時保持氬氣流量在900 mL/min,維持功率在18 W,將等離子體射流裝置插入96孔板對應孔中,讓噴嘴口與DMEM培養基液面距離保持1 mm,打開電源進行放電處理.該參數條件下的等離子體按處理時間梯度30,60,90,120,150,180 s和添加的氧氣含量梯度9,18,36,72 mL/min分別進行處理,對照組僅用氬/氧氣流不開電源進行處理,同一組參數對應三個樣品.處理后封口,在相同條件下繼續培養24 h后,觀察不同等離子體處理條件下的Hela細胞形態.隨后吸走DMEM培養基,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞三次,輕柔拍打孔板,去除沖洗溶液.每孔加入中性紅的培養液,在37°C,5%CO2和濕度適宜的環境下培養細胞3 h.去除中性紅的培養液,每孔用PBS沖洗細胞一次,輕輕倒出并吸干全部的PBS,加入中性紅的裂解液.在微量滴定平板振蕩器上快速震蕩微量滴定96孔板10 min,直至中性紅從細胞內被提取出來,并形成均勻溶液.用酶標儀測定溶液在540 nm波長處的光密度,用空白孔作為參考對照.

3 結果和討論

3.1 I-V曲線

利用高壓探頭(Tektronix P6015 A)測量加在大氣壓冷等離子體射流裝置上的電壓,利用電流探頭(Tektronix P6021)實時測量通過反應器的電流,輸出信號由示波器(Tektronix TDS 210)收集.圖3是氬/氧等離子體射流裝置放電的電壓-電流波形圖.從圖可知,電壓是正弦曲線,放電電流波形由準正弦的位移電流和眾多窄脈沖的微放電電流疊加而成,并且隨著放電電壓的波形呈現周期性變化,這是典型的絲狀放電模式.

圖3 氬-氧等離子體射流裝置放電電壓-電流波形圖(氬氣流量為900 mL/min,氧氣流量為18 mL/min;1為電壓曲線,2為電流曲線)

3.2 細胞形態學變化

圖4 等離子體處理后Hela細胞的形態學變化 (a)對照組;(b)900 mL/min氬氣;(c)900 mL/min氬氣添加18 mL/min氧氣

等離子體處理后24 h,在倒置顯微鏡下對各組細胞的生長特點及形態學進行觀察,如圖4所示.圖4(a)是未經等離子體處理的對照組細胞,細胞形態正常,呈紡錘形或多角形,輪廓清晰,邊界清楚,透明度高,立體感較強,細胞緊密貼壁,融合成片,生長旺盛.圖4(b)為900 mL/min氬氣等離子體處理Hela細胞90 s后的照片.部分細胞形態發生明顯改變,出現不同大小的圓形細胞,且胞內開始出現顆粒.圖4(c)為900 mL/min氬氣添加18 mL/min氧氣等離子體處理Hela細胞90 s后的照片,絕大部分細胞輪廓趨于模糊,立體感降低,細胞體積明顯縮小,并且呈顆粒狀崩解,出現團聚現象.

3.3 中性紅染色

圖5為利用中性紅吸收測試在氬/氧等離子體處理后24 h測定的Hela細胞存活率曲線.圖中縱坐標為處理后Hela細胞的光密度值(OD值)的平均值(在相同參數條件下,處理三組細胞)與對照組OD0值(三組未經過處理的細胞)平均值的比,橫坐標為等離子體處理Hela癌細胞的時間.如圖5所示,單純用氬等離子體處理的效果不如氬/氧等離子體的處理效果,在相同的處理時間下,添加2%氧氣的氬等離子體對Hela細胞的滅活效果最好,在180 s處理時間后,Hela細胞存活率已降低至7%.然而,當氧氣含量持續增加超過2%時,滅活Hela細胞的效果會有所減弱,直至增加到8%時,其效率甚至不如單獨的氬氣等離子體.

圖5 氧氣含量與處理時間對Hela細胞存活率的影響

3.4 發射光譜測量

圖6 OH(309 nm),Ar(774 nm),O(844 nm)相對發射強度分布與氧氣含量的關系

圖6 為OH(309 nm),Ar(774 nm),O(844 nm)發射光譜相對發射強度分布與氧氣含量的關系.在輸入功率為18 W,氬氣流量為900 mL/min的情況下,隨著氧氣含量的增加,OH(309 nm)和Ar(774 nm)的譜線強度逐漸減小.比較圖5和圖6可以發現,Hela細胞的存活率與O(844 nm)的發射光譜強度成正比.當氧氣流量為18 mL/min時,即氧氣占氬氣的體積百分含量為2%時,子宮頸癌Hela細胞的存活率最低,即等離子體的滅活效果最好,說明O(844 nm)在大氣壓冷等離子體滅活過程中起著重要作用.添加活性氣體氧氣對Hela細胞存活率的影響在于：原本氬氣只能與大氣和周圍空氣中水蒸氣作用來產生氧自由基,我們在內電極中通入氧氣,能夠使其在等離子體射流裝置的管口處與氬等離子體充分混合后再出去,因此有效增加了氧自由基的含量.然而,當氧氣含量持續增加超過2%時,滅活Hela細胞的效果會有所減弱,直至增加到8%時,其效率甚至不如單獨的氬等離子體.這是由于隨著氧含量的不斷增加,過量氧氣可能會吸收大量電子,使得氣體總電離度隨之降低,從而導致等離子體內氧自由基含量減少,影響了處理效果.

4 結論

本文設計了一種大氣壓冷等離子體射流裝置處理子宮頸癌Hela細胞.通過電流電壓探針研究了等離子體放電特性,發現氬/氧等離子體的放電模式為絲狀放電.在氬氣等離子體中添入不同百分含量的氧氣處理子宮頸癌Hela細胞,發現添加2%氧氣時,氬/氧等離子體滅活效果最佳,在180 s處理時間后,Hela細胞存活率已降低至7%.當繼續添加氧氣超過2%時,滅活效果逐漸減弱,直至8%時,其效果反而不如單純氬氣等離子體.對等離子體發射光譜進行分析,發現隨著氧氣含量的增加,OH(309 nm)和Ar(774 nm)的譜線強度逐漸減小,而O(844 nm)譜線強度先增加后減小.Hela細胞的存活率與O(844 nm)的發射光譜強度成正比,這說明在等離子體滅活Hela細胞過程中,活性氧自由基O(844 nm)起關鍵作用.

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