一氧化氮抑制甘氨鵝脫氧膽酸誘導A549細胞凋亡的實驗研究＊

荔 蕊，胡章雪，趙錦寧，汪 麗，劉 蕾，史 源

（第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所兒科，重慶 400042）

新生兒呼吸窘迫綜合征（neonate respiratory distress syndrome，NRDS）是一類重要的新生兒疾病，病死率高。近年來，國內外多家NICU報道足月兒與近足月兒NRDS患病率增加，且具備不同于早產兒NRDS的臨床特征［1-3］。妊娠期肝內膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）母親所分娩之足月新生兒患NRDS的發病率顯著增加［4-5］，機制不清楚。肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar type 2epithelium cell，AECⅡ）是合成與分泌肺表面活性物質（pulmonary surfactant，PS）的主要場所，AECⅡ凋亡增加將導致PS持續分泌不足，肺泡塌陷、萎縮，繼而發生NRDS。作者的前期研究發現：膽酸的主要成分之一甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholate，GCDC）對AECⅡ具有誘導凋亡和壞死的作用，而且可顯著減少AECⅡ中肺泡表面活性物質的合成。NO是一種可溶性氣體，可由L-精氨酸在一氧化氮合酶催化下產生。在病理狀態下，誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是 NO大量生成的關鍵酶，具有重要意義。iNOS／NO與低濃度外源性NO對于細胞凋亡具有抑制作用，臨床多中心研究發現，對嚴重呼吸衰竭的新生兒使用NO吸入治療，顯著降低了外源性PS和高頻機械通氣的使用率［6］。機械通氣初期開始使用NO吸入治療效果明顯好于呼吸衰竭嚴重時再使用［7］。上述臨床現象強烈提示NO具備降低肺動脈高壓之外的其他治療作用，聯系到項目組發現NRDS中AECⅡ的凋亡對呼吸衰竭的重要影響，以及NO可能具備抗GCDC誘導AECⅡ凋亡的作用，NO極有可能通過抑制AECⅡ凋亡而產生了對NRDS的上述治療作用。本研究擬通過細胞試驗檢測甘氨鵝脫氧膽酸誘導A549細胞凋亡模型中一氧化氮合酶的表達變化，以及外源性NO對細胞凋亡的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肺癌上皮細胞株A549細胞購自上海中科院細胞所。

1.1.2 儀器與試劑 PRMI 1640培養基 （美國GIBCO公司）；小牛血清 （美國GM公司）；甘氨鵝脫氧膽酸鹽 （sigma公司）；胰酶細胞消化液 （碧云天生物技術研究所）；caspase-3試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；一氧化氮合酶抗體及一氧化氮供體SNAP（美國Sigma公司）。

1.2 方法 （1）細胞與細胞培養從液氮罐中取出存有A549細胞的凍存管，放于37℃溫水中，用鑷子住輕輕搖動使其迅速融化。1000～2 000r／min，3～5min離心。在無菌操作臺中采用75%的乙醇徹底擦拭凍存管，然后打開凍存管，注意動作要輕柔。用1mL槍頭將上清液去除，加入1mL預熱的細胞培養液將細胞吹散開，轉移至25cm2培養瓶中。補充4mL的RPMI 1640培養基，并且添加10%的胎牛血清。倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養。24h后，更換新的培養液。細胞復蘇后常規傳代培養。待細胞呈對數期生長后用于實驗。（2）甘氨鵝脫氧膽酸誘導經典的凋亡途徑，采用熒光免疫實驗。在24孔板中放入小玻片，進行細胞爬片，將細胞分為兩組，一組加入200μmol／L GCDC，一組做空白對照。先使用caspase-3染色試劑盒對caspase-3染色熒光倒置下呈紅色，再DAPT染細胞核熒光倒置顯微鏡下呈藍色。分別拍照后，重合在一起，顯紫紅色為依賴caspase-3途徑的細胞凋亡。（3）細胞凋亡采用caspase-3檢測試劑盒進行檢測采用蛋白印跡法（Western Blot）方法檢測一氧化氮合酶表達水平，NO供體SNAP與膽酸共處理A549細胞以判斷其對細胞凋亡的作用。收集細胞，PBS洗滌，抽提細胞裂解液，蛋白定量，SDS-PAGE電泳，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜轉移，5%脫脂奶粉封閉，室溫靜置1.5～2 h，caspase-3多抗室溫反應1～2h，TBS（含0.05%Tween 20的TBS）洗3次，5～10min／次，HRP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1～2h，TBS-T洗3次，5～10min／次，NBT／BCIP顯色。

2 結 果

2.1 GCDC誘導A549細胞凋亡 為了進一步確定甘氨鵝脫氧膽酸能否誘導經典的凋亡途徑，進行了熒光免疫實驗。結果顯示，甘氨鵝脫氧膽酸處理后的A549出現了明顯的凋亡。使用caspase-3染色試劑盒對caspase-3染色呈紅色，DAPT染細胞核呈藍色，圖1中上圖為200μmol／L GCDC處理組，下圖為空白對照組，結果證明GCDC可誘導A549細胞依賴caspase-3途徑凋亡。見圖1。

2.2 GCDC抑制A549中iNOS表達 不同濃度GCDC處理A549后，細胞中iNOS的蛋白表達水平明顯降低，且具有濃度依賴性。實驗證明，GCDC可抑制iNOS在細胞中的表達水平，當GCDC濃度達到1 000μmol／L時，iNOS表達明顯受到抑制，GCDC濃度與抑制iNOS程度正相關。見圖2。

圖2 GCDC處理AECⅡ后iNOS的表達變化情況

2.3 外源性NO抑制GCDC誘導的A549凋亡 以NO供體SNAP（0～1mmol／L）單獨處理 AECⅡ時，細胞不發生凋亡；GCDC可誘導AECⅡ凋亡，但用SNAP和GCDC共處理AECⅡ后則降低了細胞的凋亡程度。見圖3。

圖3 NO供體SNAP與對GCDC誘導AECⅡ凋亡的影響

3 討 論

ICP主要臨床表現為皮膚瘙癢、黃疸及肝功能異常，可導致孕婦和胎兒的并發癥。ICP主要危害胎兒，可致胎兒宮內窘迫、流產、死胎等，增高圍產兒發病率和死亡率。ICP最常發生在孕晚期，但在妊娠期間也可以隨時發病。ICP對孕婦的影響不大，但是對胎兒有很大影響，有研究顯示與正常妊娠相比，ICP患者臍帶血孕激素重硫酸化代謝產物含量高，胎兒類固醇硫酸鹽水平合成量降低，使胎兒類固醇合成功能受損。1883年就報道了ICP，描述ICP為妊娠期間復發性黃疸，分娩后消失。很多研究證實激素在ICP治病機制中起著重要作用。ICP最常見于經產婦，在經產婦與初產婦的發病率分別為20.0%和4.7%。ICP通常發生于懷孕的后3個月，為雌激素水平的高峰時期有ICP家族史的婦女，服用避孕藥后也會出現ICP的臨床癥狀。黃體酮及代謝產物也可能是發病機制，Bacq等［8］做了臨床實驗，12例先兆早產患者有11例有服用過天然孕激素治療。

NRDS又稱為肺透明膜病（hyaline membrane disease，HMD），是由PS缺乏而導致，以出生后不久便出現呼吸窘迫呈進行性加重的綜合征，是新生兒重癥監護室常見的危急重癥，發病率及病死率高［9］，臨床癥狀以呼吸急促困難、呻吟為主要表現。PS是由AECⅡ合成分泌的磷脂蛋白復合物，胎兒在18～20周AECⅡ已經能夠分泌少量的PS轉移至肺泡表面，隨胎齡增長，PS的合成分泌量增高，所以本病易發生于早產兒，胎齡越小，發病率越高，足月兒與近足月兒（胎齡大于或等于35周）的發病率是較低的［3］。近年來，國內外多家NICU報道足月兒與近足月兒NRDS患病率增加，且具備不同于早產兒NRDS的臨床特征［1-2，10］，所以早產并不是PS分泌不足致NRDS的主要原因。圍生期窒息、前置胎盤、胎盤早剝及孕婦低血壓致胎兒血容量下降等均能誘發胎兒的呼吸窘迫癥。最新的研究表明，母親患有ICP時，胎兒NRDS發病概率顯著增高。

膽汁酸對孕婦和胎兒的毒性作用，妊娠中晚期胎兒和母體合成的膽汁酸都是通過胎盤轉運的，Ding等［11］發現膽汁酸可能損害細胞器從而導致多核細胞生理功能失常，影響胎盤合成和轉運功能。孕婦膽汁酸升高，可導致胎盤絨毛間隙狹窄，胎盤灌注量減少；膽汁酸有濃度依賴性血管收縮作用，高濃度膽汁酸使絨毛血管痙攣，從而導致胎盤灌注不足，發生胎兒窘迫。膽汁酸通過胎盤進入胎兒體內后，其細胞毒作用破壞線粒體膜產生氧自由基，從而導致胎兒的氧利用障礙［12］。膽酸鹽可刺激腸蠕動，但是膽酸過高，便會造成羊水胎糞污染。各種炎癥細胞在肺內積聚、黏附、激活同時釋放大量的活性氧和蛋白酶，直接或間接引起胎兒的肺損傷，從而增加新生兒窒息，及吸入性肺炎的概率，患NRDS的風險明顯升高［13］。

本實驗通過研究一氧化氮抑制甘氨鵝脫氧膽酸誘導A549細胞凋亡，為預防和治療NRDS尋找新的治療方法和藥物靶點，從而降低NRDS的發生率。

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