太白楤木總皂苷對肝纖維化大鼠Smads4基因表達的影響

崔大江 楊渭臨 李秀麗

西安交通大學醫學院第二附屬醫院老年醫學科 (陜西西安，710004)

本研究旨在觀察太白楤木總皂苷對四氯化碳 (CCl4)誘導的肝纖維化大鼠肝臟膠原沉積的影響，了解其對大鼠肝臟Smads4基因表達的影響，進一步從分子水平探討太白楤木總皂苷干預實驗性大鼠肝纖維化的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料 化學純CCl4［批號20000923，上海華東試劑公司產品］，太白楤木總皂苷 (由本院藥劑科提供);大鼠Smads4 mRNA探針及原位雜交試劑盒 (上海申能生物工程公司);大鼠Smads4蛋白SABC免疫組化試劑盒 (英國abcam公司生產)，BCIP/NBT為北京中山生物技術有限公司產品;TGFβ1-ELISA試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司);其余試劑為分析純。

1.2 動物與分組 體質量 (150±10)g健康SD雄性大鼠80只 (購自西安交通大學醫學院實驗動物中心)，隨機分為3組:對照組20只，肝纖維化組 (簡稱模型組)30只，用CCl4皮下注射 (SC)法造模 (化學純CCl4配制成300ml/L濃度的石蠟油溶液，SC劑量3ml/kg，2次/wk×8wk)，太白楤木總皂苷組 (簡稱治療組)30只，造模同時給予太白楤木總皂苷滅菌水溶液 (濃度100g/L，劑量5mg/kg，2次/wk×8wk)ip，大鼠肝組織以40g/L中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，以多聚賴氨酸涂布的載玻片制作切片。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠血清TGFβ1檢測 參照試劑說明書采用ELISA法分別加入待測血清，二抗，顯色劑，反應后用酶標儀讀數測定血清TGFβ1含量。

1.3.2 肝組織病理學檢測 肝組織切片HE染色，Masson膠原染色作組織病理學檢查，顯微鏡下觀察，以計算機圖像分析系統進行膠原含量定量分析。

1.3.3 大鼠肝組織Smads4蛋白表達免疫組化檢測 切片常規脫蠟至水，經微波修復抗原，抗Smads4多克隆抗體稀釋度為1∶100，以PBS代替一抗作陰性對照;切片依次加一抗、生物素化二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，隨機選取每張切片10個視野 (×200倍)測定陽性細胞的所占視野細胞的比例，以計算機圖像分析系統進行Smads4蛋白表達水平定量分析。

1.3.4 大鼠肝組織Smads4 mRNA表達原位雜交檢測Smads4探針濃度為5μmol/L，切片常規脫蠟至水，經復合酶消化，預雜交，雜交，封閉等步驟，NBT/BCIP顯色，核固紅復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，隨機選取每張切片10個視野 (×200倍)，測定陽性細胞所占的比例，以計算機圖像分析系統進行mRNA表達水平定量分析。

2 結果

2.1 太白楤木總皂苷對大鼠血清TGFβ1水平的影響 見表1。

表1 各組大鼠血清TGFβ1水平及肝組織膠原面積比例比較(xˉ±s)

2.2 太白楤木總皂苷對大鼠肝組織病理學改變的影響 見表1。模型組大鼠肝臟呈黃褐色，表面布滿細小結節，HE染色可見肝細胞廣泛變性、壞死，以中央靜脈周圍為重;Masson染色見正常 (對照組)肝臟膠原纖維含量稀少 (平均每個視野約占肝組織總面積的0.011)，模型組大鼠肝臟膠原纖維顯著增生，匯管區－中央靜脈區纖維間隔寬大，膠原纖維顯著增生并包繞分隔肝小葉，部分已形成假小葉。

2.3 太白楤木總皂苷對大鼠肝組織Smads4表達的影響 見表2。免疫組化染色可見，正常大鼠肝組織未檢出明顯的Smads4表達，模型組大鼠肝組織則Smads4表達明顯增加，棕黃色陽性顆粒定位于細胞質和細胞核，陽性細胞集中于匯管區，以梭狀的間質細胞為主，肝細胞未見明確陽性反應;太白楤木總皂苷干預組大鼠肝組織Smads4表達較模型組明顯減少，陽性細胞亦主要位于匯管區，以間質細胞為主。原位雜交檢測正常肝組織未見明顯Smads4 mRNA陽性表達細胞;模型組大鼠肝組織有大量Smads4 mRNA陽性細胞，肝實質細胞與間質細胞均有表達，藍紫色陽性顆粒主要定位于細胞質。

表2 各組大鼠肝組織Smads4表達陽性率比較(±s)

表2 各組大鼠肝組織Smads4表達陽性率比較(±s)

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n Smads4蛋白Smads4 mRNA對照組 20 0△△ 0△△模型組 30 0.135±0.086 0.723±0.090治療組 30 0.024±0.007△ 0.229±0.019△

3 討論

多項研究表明，TGFβ1-Smad信號通路是肝纖維化時主要的信號轉導通路［1］，Smads是一族傳遞TGFβ信號的分子，Smads4則為傳遞信息必須的共用Samds分子，阻斷或干擾該信號轉導通路有可能阻止肝纖維化進程［2］，為肝纖維化的治療帶來了新希望。目前已從化學藥物、細胞因子、基因調控等方面對抗肝纖維化進行了廣泛的探索，結果不盡如意。我國學者在對中草藥的研究中發現，不少中藥在控制肝纖維化方面具有一定的療效，顯示了良好的發展前景［3］。這些藥物價格低廉，副作用小，易于為患者所接受，但多數中藥療效研究僅限于動物實驗或簡單臨床觀察，缺乏系統的分子水平研究。太白楤木總皂苷是太白楤木的主要成份，研究表明［3～5］，太白楤木總皂苷具有一定的抗乙肝病毒、抑制肝星狀細胞核因子κB活性及抗肝纖維化的作用。

本研究結果表明:CCl4誘導的大鼠肝纖維化出現Smads4表達明顯增加，反映肝纖維化病變的進展;太白楤木總皂苷水溶液能夠有效地減輕CCl4誘導的肝組織損害和肝臟膠原沉積，降低大鼠血清TGFβ1水平，Smads4蛋白及Smads4 mRNA表達陽性率均下降，太白楤木總皂苷減弱Smads4基因的表達，有效地干預了TGFβ介導的肝纖維化信號轉導過程，這可能是其抗肝纖維化分子機制之一。

［1］ GRESSNER AM，WEISKIRCHEN R，BREITKOPF K，et al.Roles of TGF-beta in hepatic Fibrosis ［J］ .Front Biosci，2002，152(2):793－807.

［2］ KONDOU H，MUSHIAKE S，ETANI Y，et al.A blocking peptide for transforming growth factor-betal activation prevents hepatic fibrosis in vivo［J］，J Hepatol，2003，39(5):742－748.

［3］崔大江，楊渭臨，李秀麗.太白楤木總皂苷對HBV DNA的影響［J］.中西醫結合肝病雜志，2011，21(4):216－218.

［4］崔大江，聶丹麗，衣蕾.太白楤木對大鼠肝星狀細胞核因子-κB活性表達的影響 ［J］.遼寧中醫藥大學學報，2010，12(4):48－49.

［5］崔大江，楊渭臨，李秀麗.太白楤木總皂苷體外對乙肝病毒HB-sAg、HbeAg的影響［J］.同濟大學學報 (醫學版)，2012，33(2):47－49.