綠盲蝽胚胎發育的顯微及切片觀察

田彩紅， 何 璠， 封洪強， 李國平， 邱 峰

（河南省農作物病蟲害防治重點實驗室，農業部華北南部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河南省農業科學院植物保護研究所，鄭州 450002）

Bt棉的大面積種植有效控制了棉鈴蟲［Helicoverpa armigera（Hübner）］的發生為害［1］，棉田廣譜性化學農藥的使用量隨之大幅度減少，而盲蝽種群發生數量劇增、為害加重，成為當前我國Bt棉上的首要害蟲，并波及其他多種寄主植物。綠盲蝽［Apolygus lucorum （Meyer－Dür）］以滯育卵在棗、葡萄、桃、蘋果、櫻桃等寄主上越冬，滯育行為有效保證了綠盲蝽抵御冬季的不良環境。越冬代若蟲孵化后刺吸為害果樹的生長點和嫩葉，造成嫩芽畸形等癥狀，為害十分嚴重。因此，果樹上越冬代綠盲蝽的初孵期就成為其防治的關鍵時期。研究綠盲蝽的胚胎發育及卵滯育發生的胚胎發育規律對于綠盲蝽的預測預報以及可持續防控具有重要實踐意義。目前，對盲蝽的研究多集中在生物學特性、寄主適合度、發生規律、防控技術等方面［2－4］，而由于綠盲蝽將卵產于寄主植物的組織中，不便觀察和研究，綠盲蝽的胚胎發育及滯育卵的胚胎發育規律尚不明確。

本文通過對綠盲蝽不同階段胚胎發育的顯微照相和石蠟切片制作，觀察了滯育卵和非滯育卵胚胎發育動態，明確了其滯育卵發育的階段胚胎發育特征，并測定了滯育卵和非滯育卵在其發育進程中的卵重變化，以期為早春綠盲蝽滯育卵孵化動態的預測預報提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

綠盲蝽的自然種群采自河南新鄉原陽縣河南現代農業研究開發基地（35°00′N，113°42′E）的 Bt棉田，以綠盲蝽人工飼料在（26±0.5）℃、80%RH 和L∥D＝16h∥8h的試驗條件下繼代飼養，建立非滯育種群。滯育卵采用光周期誘導的方式獲得，即從1齡若蟲開始飼養在L∥D＝8h∥16h的光周期下，成蟲所產的卵為滯育卵［5］。在產卵期將鋪有4層濕濾紙的培養皿放入養蟲盒內讓其產卵到濾紙上［6］并在（26±0.5）℃孵育。在卵孵育的第0（產卵當天）、1、2、3、4、5、6d，用滅菌蒸餾水浸潤濾紙，用彎頭鑷子輕輕將卵剝出放入多聚甲醛固定液中固定，并做好標記，供石蠟切片使用。

1.2 不同發育時期胚胎的形態觀察

在載玻片上滴一滴PBS緩沖液，將經多聚甲醛固定后的卵展著其上，利用 Motic（moticampro）昆蟲解剖顯微鏡初步觀察并拍照，選擇具有典型特征的非滯育卵和滯育卵［7］，制作石蠟切片。

切片的制作方法由透射電鏡切片的制作方法改良而來［8］，具體為：將固定好的綠盲蝽卵經70%、85%、95%、100%、100%乙醇，每級1h，梯度脫水；將脫水后的材料放入溶化的石蠟（56～58℃）溶液中，置于65℃烘箱中2h，取出換一次石蠟，再置于67℃烘箱中2h，之后取出用石蠟常規包埋。使用KD－2258－VI型石蠟切片機（浙江省金華科迪儀器有限公司）切片，切片厚度為5μm。之后貼片。貼片之前將新的蓋片和載玻片放入95%乙醇內浸泡10min，蒸餾水沖洗干凈后再放入95%乙醇中浸泡，然后用干凈白布擦拭，手指不要接觸玻面，為增加載玻片的黏附力，在載玻片上涂上一層甘油蛋白后用毛筆輕柔貼片。然后按以下步驟浸潤：二甲苯浸潤2次，每次10min。之后脫蠟：甲苯乙醇混合液（1∶1）浸潤15min，100%乙醇浸潤2次，每次5min，95%乙醇浸潤5min，85%乙醇浸潤5min，70%乙醇浸潤5min，1%番紅37℃恒溫箱中浸潤70min，70%乙醇浸潤2次，每次1min，85%乙醇浸潤2次，每次1min，95%乙醇浸潤2次，每次1min，0.5%固綠浸潤10s，100%乙醇浸潤2次，每次1min，甲苯乙醇混合液（1∶1）浸潤1min，二甲苯浸潤2次，每次1min，中性紅染色5min，乙醇鹽酸分化（70%乙醇＋30%鹽酸），并用中性紅重染色；BA3000i顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）觀察照相，最后用中性樹膠封片。

1.3 卵重的測定

取剛產下的卵100粒，用分析天平準確稱其重量，稱完后，放進溫度為（26±0.5）℃，相對濕度約80%的恒溫箱中使其繼續發育，以后在每天相同時間點，在每片產卵的濾紙上噴布500μL的蒸餾水，稱重一次，直至孵化為止［9］，各處理重復3次。數據分析利用SPSS13.0進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 綠盲蝽非滯育卵的胚胎發育

產卵后第0天：滯育卵表面淺綠色，細胞均勻排列（圖1a），初產的綠盲蝽非滯育卵為乳白色，細胞周質及細胞均勻排列（圖1b）。

產卵后第1天：卵經過24h的發育后，在盲蝽滯育卵內，細胞大小不一，沒有胚帶出現（圖1c）。非滯育卵的縱切面，細胞呈現圓點狀分散于卵中央部分的卵黃內，排列整齊，形成一層單細胞的囊胚層，里面胚帶依稀可見（圖1d）。

產卵后第2天：滯育卵的卵殼對光的通透性明顯地低于非滯育卵殼的通透性，通過透射光，即使增大顯微鏡的光強，依然看不到滯育卵殼內的內容物。非滯育卵細胞層加厚，形成胚帶。但是滯育卵體內細胞呈點狀不規則分布，并有巨細胞出現，也可能為冰晶。細胞在形成單細胞的囊胚層后，隨著細胞層的加厚，并沒有形成胚帶（圖1e，圖1f）。

產卵后第3天：胚胎頭部正置于卵的前端，長條形的胚胎已經形成（圖2a），腹部細長，明顯分節，附肢已形成但尚未分節（圖2b）。

產卵后第4天：原頭變短，分節明顯。腹部分節明顯，中部膨大，端部略窄（圖2c），紅色眼點形成，頭部向外突起（圖2d）。

產卵后第5天：腹部各節的腹板劃分明顯。卵的整體外形變成彎香蕉型，卵殼發黑，紅色復眼清晰可見（圖2e和圖2f）。

圖1 綠盲蝽滯育卵和非滯育卵的胚胎發育（產卵后0～2d）Fig.1 Diapause and non－diapause egg embryonic development of Apolygus lucorum（0～2days after oviposition）

產卵后第6天：卵的整體變長，卵的顏色變成翠綠色，卵殼和胚體分離，卵的頸部變長拉伸，卵殼破裂（圖2g），若蟲孵出卵蓋延伸變長成漏斗狀（圖2h）。

2.2 滯育卵的發育停滯期

為進一步明確滯育卵的胚胎發育階段，切片觀察發現：在產卵后48h滯育卵卵殼較厚，周質明確可見，細胞呈現不規則狀排列，卵蓋呈馬鞍狀（圖3）。而非滯育卵切片可看到卵表皮層脫離胚盤，合核開始分裂并形成很多子核，胚帶清晰可見，胚胎發育正在進行，進入了胚胎伸長階段。

2.3 綠盲蝽發育過程中滯育卵和非滯育卵卵重的變化

綠盲蝽卵初產出時較輕，滯育卵每百粒重（2.6±0.66）mg，而非滯育卵每百粒重為（2.33±0.40）mg，兩者重量相似，但是隨著發育歷期的延長，非滯育卵的重量和滯育卵的重量呈現不同的變化趨勢（圖4）。綠盲蝽非滯育卵從產出到孵出若蟲的過程中，卵重不斷在增加，至孵化時卵重增加了5倍多，但滯育卵重量基本保持不變（圖4）。

圖2 綠盲蝽非滯育卵的發育（產卵后3～6d）Fig.2 Non－diapause egg embryonic development of Apolygus lucorum（3～6days after oviposition）

3 討論

越冬是綠盲蝽生活史中重要的組成部分，綠盲蝽以卵滯育的方式越冬，越冬期為每年9月中下旬至翌年4月上旬［10］。本研究通過切片觀察和卵重測量，明確了綠盲蝽滯育卵停滯發育的時期。滯育卵在26℃下經過24h的胚胎發育，在形成單細胞的囊胚層后沒有形成胚帶，而且卵重不再增加，因此，可以確定綠盲蝽卵的滯育是發生在囊胚后期，即在26℃條件下產卵后第1天。據此推斷滯育卵越冬后的發育歷期應與非滯育卵歷期相似或略短。因此在測報實踐中，可以利用非滯育卵的有效積溫和發育起點預測越冬卵的孵化時間。然而，室內低溫解除滯育的試驗卻發現滯育解除后卵的發育歷期明顯長于非滯育卵［11－15］。這種滯育后發育歷期的延長可能是由于低溫條件未完全解除滯育所致，也有可能是綠盲蝽滯育卵越冬后存在一個與非滯育卵不同的胚胎發育階段。因此，有必要對綠盲蝽的滯育后發育進行系統研究，以提高該害蟲始發期預測的準確度。

昆蟲的胚胎發育是一個復雜的過程，自精子經卵孔進入卵內，形成合核，經歷卵裂、胚盤、胚帶、胚層及胚膜的形成，至胚胎的分節、附肢的生成、體壁形成及背合等過程。目前關于昆蟲胚胎發育的研究報道，大多數是對于膜翅目、鱗翅目，直翅目和脈翅目昆蟲胚胎發育的研究［16－20］，而對半翅目昆蟲胚胎發育研究較少。不少學者根據胚胎發育歷期，人為地分為幾個階段，陳偉等詳細描述了直翅目越北腹露蝗的胚胎發育過程，并將其分為10個階段［21］。早在1966年，劉秀瓊等對荔枝蝽象的胚胎發育進行了研究，通過石蠟切片法，把胚胎發育分為囊胚層形成，胚體伸長等13個階段［9］。在本研究中，我們根據綠盲蝽卵在26℃下的發育歷期，逐日描述了綠盲蝽的胚胎發育過程，為進一步研究綠盲蝽卵的滯育后發育奠定了基礎。

滯育卵由于停止發育卵重保持恒重，而非滯育卵則由于發育過程中需要吸收水分卵重穩步上升。這與Constant等［22］觀察到的一種盲蝽（Macrolophus caliginosus Wagner）的胚胎發育過程中鮮重不斷增加的結果［22］一致。這是由于盲蝽的卵深埋在植物組織內，胚胎在發育過程中不斷從植物組織內吸收水分，M.caliginosus卵的干重在孵化過程中沒有變化，但鮮重卻增加了一倍［22］。而在本研究中，綠盲蝽非滯育卵卵重增加了5倍多，因而，環境濕度成為綠盲蝽卵正常孵化的主要限制因子之一。而滯育卵由于其卵殼較非滯育卵卵殼厚，可能形成了像荔枝蝽象卵一樣的較強的卵內環境保護機制［9］，從外界吸收的水分較少，有利于滯育卵度過不良環境。因此，春季降水比冬季降水對綠盲種群的影響更大，在測報實踐中應重點尋找春季降水與發生期發生量之間的關系。

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