過氧化物酶體增殖物激活受體β／δ激動劑GW0742對硝酸甘油誘導偏頭痛大鼠的作用

肖明明，何 秋，任占秀，陳曉虹

（遼寧省人民醫院1．病理科；2．神經內科，遼寧 沈陽110016）

偏頭痛（migraine）是一種常見的神經系統疾病。最新流行病學調查表明，我國偏頭痛的患病率、發病率有逐年上升的趨勢［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators－activated receptor，PPAR）是核受體超家族成員之一，包括PPARα、PPARβ／δ 和 PPARγ 三種表型。PPARα和PPARγ激動劑的抗炎作用已通過大量研究證實，但是 PPARβ／δ的作用仍不十分清楚［2］。研究PPARβ／δ在炎癥等疾病中的表達可能具有十分重要的意義［3］。因此，建立客觀有效的偏頭痛實驗動物模型，深入研究PPARβ／δ激動劑對偏頭痛的發病機理及防治措施十分必要。

1 材料與方法

1．1 材料

硝酸甘油購于廣州白云山制藥有限公司；PPARβ／δ，IL－6，ICAM－1，MMP－9試劑盒購于Santa Cruz公司；GW0742由Sigma生產，批號：096K 4711。GW0742溶于二甲基亞砜溶劑（dimethylsulfoxide，DMSO）中。

1．2 實驗分組及造模

48只SD雄性大鼠（體重180－220g）由沈陽藥科大學實驗動物部提供。動物許可證號，No：SCXK（遼）2010－0001。按體重均衡原則，將大鼠隨機分成：正常對照組、模型組和GW0742組，每組16只。模型組按Tassorelli Cristina法采用腹腔皮下注射硝酸甘油復制大鼠偏頭痛模型。GW0742組在造模后3 0min腹腔給予 GW0742 0．3mg／kg。正常對照組不做處理。

1．3 偏頭痛模型制備

取大鼠稱重，大鼠按9．5mg／kg皮下注射硝酸甘油5－10min所有造模后大鼠出現雙耳發紅，肢頻繁撓頭、爬籠次數增多、煩躁不安等現象。據模型評分標準（潛伏期后5min，計分達6分為造模成功）。對照組大鼠皮下注射等體積生理鹽水，大鼠僅在15 min內略有撓頭現象，之后趨于正常，且未出現雙耳發紅、爬籠次數增多和其他煩躁不安現象［4］。

偏頭痛模型評價：根據本研究預實驗結果，潛伏期后5min內出現癥狀最為集中和明顯。所以確定潛伏期后5min計分達6分為造模成功。前5 min搔頭：10次＝1分（依10次為基數，增加1次，增加0．1分），打轉：2次＝1分（增加1次，增加1分），爬籠：3次＝1分（增加1次，增加0．1分），煩躁：往返運動1次＝1分（增加1次，增加1分），咬尾：1次＝1分，耳紅：出現＝1分［5］。

取材：造模成功4h后，10%水合氯醛麻醉后暴露心臟，從心尖插入灌流針直至主動脈，剪開右心耳，用0．9%生理鹽水沖洗至流出水無色后，每組取8只鼠的腦干三叉神經頸復合體，迅速置入液氮中保存，備用于western blot檢測；另8只鼠在上述生理鹽水沖洗后用4%多聚甲醛灌流，直至腦組織發白、質地較硬后灌流結束。斷頭取腦干三叉神經頸復合體，放入4%多聚甲醛液中固定，24h后移入70%乙醇中保存，常規石蠟脫水、包埋，待做免疫組化。

1．4 免疫組織化學

石蠟組織切片行常規HE染色，顯微鏡下觀察確定組織結構未被破壞，行脫蠟和水化后，用0．01 mmol／L枸櫞酸鹽修復，冷卻至室溫；新配的3%H2O2，室溫下處理10min，蒸餾水洗滌切片2min×3次；滴加封閉用正常山羊血清工作液體，37℃孵育20min；滴加適當一抗［PPARβ／δ（1∶200）、IL－6（1∶200）、ICAM－1（1∶200）、MMP－9（1∶200）］，4℃過夜；PBS沖洗，3min×3次，滴加生物素抗體，37℃孵育20min；PBS沖洗，3min×3次，滴加適量的辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min，PBS沖洗，3min×3次，DAB顯色：取1ml蒸餾水分別加入A、B、C試劑各一滴，混勻后加至切片上，顯色5－10min，水洗；蘇木素輕度復染，水洗，脫水、透明、封片，鏡檢觀察。

結果判斷：PPARβ／δ蛋白定位于細胞核，IL－6、ICAM－1、MMP－9蛋白定位于細胞質。根據陽性細胞百分率評分：無陽性細胞為（－），陽性細胞數≤10%（＋），11%≤陽性細胞數≤50%為（＋＋），陽性細胞數≥51%為（＋＋＋）。

1．5 Western－blot印 跡 法 檢 測 PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及 MMP－9表達

1．5．1 蛋白提取 分別取凍存的組織，加0．5ml冰冷蛋白裂解緩沖液（0．1mM Tris－HCl pH7．6，1 mM EDTA pH8．0，1μg．ml－1Aprotinin，100μg·ml－1PMSF），冰浴中勻漿，4℃、10 000×g離心1h；棄上清，沉淀物中加入0．5ml細胞核或膜裂解緩沖液，超聲粉碎，4℃、20 800×g離心1h，吸出上清（分別含胞核蛋白或胞膜蛋白），采用Folin－酚試劑法進行蛋白定量，－70℃保存待用。

1．5．2 Western－blot印跡 分別取含30μg含胞核蛋白或胞膜蛋白的上述溶液，加在10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠中，在pH 為8．3的0．025M／L Tris－192μm／L 甘氨酸－0．1%SDS中電泳（120V、38 mA）2h。電轉移到硝酸纖維薄膜上，轉印膜在牛血清白蛋白中封閉1小時后，分別在一抗［PPARβ／δ（1：200）、IL－6（1∶200）、ICAM－1（1∶200）、MMP－9（1∶200）］中4℃孵育過夜。次日，充分清洗轉印膜后，轉入堿性磷酸酶（1∶3000稀釋）標記的二抗中室溫孵育2h，PBS沖洗3次，顯色30s。凝膠自動成像儀掃描成像，圖像分析儀對顯示的蛋白電泳條帶進行數據分析。

1．6 統計學處理

測定數值以均數±標準差（ˉx±s）表示，兩組間均數比較用t檢驗，統計學分析用SPSS13．0統計軟件處理，差異具有統計學意義（P＜0．05）

2 結果

2．1 大鼠行為學變化

造模5－10min后大鼠出現耳發紅，肢頻繁撓頭、爬籠次數增多、煩躁不安等現象約30min達高峰。此現象可持續1h。繼之大鼠呈現蜷臥，活動減少狀態。期間無大鼠死亡，根據偏頭痛模型評價，大鼠模型結果符合標準。

2．2 免疫組織化學

模型組大鼠三叉神經頸復合體中PPARβ／δ表達強度明顯高于正常對照組。同時模型組大鼠三叉神經頸復合體IL－6、ICAM－1、MMP－9表達強度明顯高于正常對照組，給予PPARβ／δ激動劑GW0742大鼠三叉神經頸復合體IL－6、ICAM－1、MMP－9表達強度下降（圖1）。

圖1 免疫組化法檢測大鼠腦干三叉神經頸復合體PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及 MMP－9蛋白表達（SP染色法×100）

2．3 Western blot檢測

模型組大鼠三叉神經頸復合體PPARβ／δ表達明顯高于生理鹽水對照組，GW0742組PPARβ／δ表達明顯高于模型組，差異均有統計學意義。同時模型組大鼠IL－6、ICAM－1及 MMP－9表達明顯高于生理鹽水組，給予PPARβ／δ激動劑GW0742大鼠IL－6、ICAM－1及 MMP－9表達下降，差異有統計學意義（圖2、3）。

3 討論

圖2 Western bolt法檢測大鼠腦干三叉神經頸復合體PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及 MMP－9蛋白表達

圖3 大鼠三叉神經頸復合體PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及MMP－9蛋白表達（各組與參照密度值比值，ˉx±s，n＝24）

偏頭痛（migraine）是一種常見的神經系統疾病。在偏頭痛發病機制的諸多學說中三叉神經－血管反射學說占主導地位，越來越受到廣泛關注。偏頭痛的發生是由于某種原因激活了腦血管周圍的三叉神經末梢，三叉神經周圍血管纖維釋放血管活性肽等，使腦膜血管過度擴張，血漿蛋白滲出，肥大細胞釋放組胺，引起硬膜和其他三叉神經分布組織發生神經源性炎癥，這種傷害性刺激沿著三叉神經傳入纖維傳至三叉神經核尾部，沖動達到延腦化學感受區，引起惡心、嘔吐；傳入下丘腦，出現畏光癥狀，傳入大腦皮質產生痛覺［6］。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators－activated receptor，PPAR）是配體活化的核轉錄因子，其活化后能產生多種生物學作用，如調解脂質代謝、提高胰島素敏感性和抗腫瘤作用等。PPAR 包括 PPARα、PPARβ／δ 和 PPARγ 三種亞型。在這三種亞型中，PPARα和PPARγ激動劑的抗炎作用已通過大量研究證實，但是，另一種亞型PPARβ／δ的研究相對滯后，其作用還不十分清楚［6］。PPARβ／δ在中樞神經系統中表達最豐富，于各腦區神經元、膠質細胞、腦血管內皮和單核巨噬細胞等細胞均有表達［7］。

GW0742為 PPARβ／δ 的特異性激動劑，與GW501516一起于2003年首次確認［8］。鑒于偏頭痛時產生神經源性炎癥，因此本實驗研究偏頭痛時PPARβ／δ的表達及GW0742對偏頭痛的作用，對預防和治療偏頭痛可能具有十分重要的意義。

本實驗 中偏頭 痛 模 型 組 中IL－6、ICAM－1 及MMP－9表達增強，PPARβ／δ表達上調。PPARβ／δ激 動 劑 使 偏 頭 痛 鼠 炎 性 因 子 IL－6、ICAM－1 及MMP－9表達下調，提示PPARβ／δ在偏頭痛高度表達，PPARβ／δ激動劑具有抗炎作用。Wahli W 等［9］研究表明PPARβ／δ可以推遲TNF－α等炎癥因子在損傷部位的產生，調節細胞適應應激狀態，遠離炎癥因子的凋亡信號，還能控制巨噬細胞的炎癥狀態。PPARβ／δ激動劑可以強有力的減少INF－γ和LPS誘導的 TNF－α和IL－6及iNOS、COX2的表達上調［10］；給予 PPARβ／δ激動劑后發現 MCP－1、IL－1β的表達水平下降［11］。Northern blot分析發現 MCP－1、IL－1β和 MMP－9是PPARβ／δ控制巨噬細胞炎癥的重要靶點。不僅如此，在之前作者的研究中已經證實PPARβ／δ的抗炎性可以通過NF－κB途徑調節介導，使下游炎癥因子如IL－1、IL－6、TNF－a、ICAM－1表達減少，從而減少炎癥因子的啟動，達到控制炎癥的作用［12］。本實驗與上述實驗結果一致，表明PPARβ／δ可能通過下調IL－6、ICAM－1 及 MMP－9等炎性因子表達而發揮抗炎作用［8－10］，同時也說明PPARβ／δ激動劑GW0742通過抗炎機制對偏頭痛起保護作用。

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