脂聯素在脂肪組織切口愈合中的作用及機制研究

濮 勇，陶 曙，姜 洋，肖 亮

（1．江蘇大學附屬人民醫院 普外科，江蘇 鎮江212000；2．吉林大學中日聯誼醫院 普外科；3．深圳大學附屬第一人民醫院 生物治療科）

切口并發癥是最常見的腹部手術術后并發癥，發生率約為7%－26%［1－3］。常見的切口并發癥類型包括：脂肪液化、切口積液／血清腫、切口裂開、切口感染等。其中，脂肪液化是最常見的切口并發癥，好發于肥胖患者。體重指數與血清脂聯素水平負相關。脂聯素（Adiponectin，ADPN）是脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性多肽［4－7］。ADPN可通過與受體結合來激活AMPK增強胰島素敏感性，增加促進骨骼肌細胞的脂肪酸氧化和糖吸收，明顯加強胰島素的糖原異生作用、抑制肝臟的糖生成，是機體的脂質代謝和血糖穩態的調控網絡中的重要調節因子。在內皮細胞中的研究發現，ADPN可以通過和受體結合抑制Caspase蛋白的活化、抑制細胞凋亡，但ADPN是否可以抑制脂肪細胞凋亡及其介導細胞凋亡的具體通路仍然未知［8］。

1 材料與方法

1．1 材料

長白山大豬［購自廣東省醫學實驗動物中心SLXY（粵）2006－0002］，重組人脂聯素（Prospec公司），二 抗：Anti－Adiponectin Receptor 1antibody［EPR6626］（Rabbit monoclonal）及 Goat anti－Rabbit IgG H＆L （HRP）secondary antibody（英 國ABCAM 公司）；Anti－Adiponectin Receptor secondary antibody（Goat polyclonal）和 Donkey anti－Goat IgG H＆L （HRP）secondary antibody（英國ABCAM公司）；總蛋白提取試劑盒（欣百諾公司）；BCA蛋白定量試劑盒（健康元公司）；ECL發光試劑盒（pierce公司）；Annexin－V－FITC凋亡檢測試劑盒（碧云天生物科技有限公司）。

1．2 制作ATWH動物模型

采用50kg重的長白山大白豬。取俯臥位，靜脈誘導麻醉成功后，消毒鋪巾。后背正中線為對稱線，旁開3cm，左右兩側各取7個長約4cm切口，全層切開脂肪組織。兩側切口隨機分為脂聯素干預組和對照組。術后每天依次打開一個切口，留取局部脂肪組織，并觀察脂肪組織切口愈合等級。

1．3 應用免疫熒光技術檢測細胞凋亡

取脂肪組織常規固定，包埋，切片。脫蠟脫水后備用，用預冷的PBS洗滌3次。然后按試劑盒操作說明取AO和EB等體積混勻制成AO－EB熒光染液，用PBS按1∶25稀釋后加10μl避光染色10 min。然后用預冷的PBS洗去未結合的染液，5%甘油封片，熒光顯微鏡檢測。

1．4 應用電鏡技術檢測細胞凋亡

取脂肪組織經3%戊二醛前固定，2%鋨酸后固定，緩沖液沖洗后，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色過夜。清洗2次，梯度丙酮脫水，包埋，超薄切片機切片，JEM2000－EX透射電鏡隨機拍片。

1．5 統計學處理

計量資料以均數±標準差（ˉx±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。應用SPSS 16．0軟件做統計分析。以P＜0．05為有統計學意義。

2 結果

2．1 切口愈合等級

脂聯素干預組Ⅰ期切口愈合等級明顯優于對照組，兩組之間的差異有統計學意義（P＜0．05）。兩組切口脂肪液化發生率及切口感染發生率差異均無統計學意義（P＞0．05）（表1）。

表1 兩組之間切口愈合情況的比較

2．2 熒光標記法觀察豬ATWH中脂肪細胞凋亡的變化

分別于術后第3d及第5d應用熒光標記法觀察豬ATWH中脂肪細胞凋亡的變化。熒光顯微鏡掃描結果提示，兩組脂肪細胞都存在細胞凋亡，第3 d和第5d脂聯素干預組出現凋亡的脂肪細胞均遠低于對照組（P＜0．05）。見圖1、表2。

圖1 A脂聯素干預組術后第3d見少量脂肪細胞凋亡，脂肪組織結構清晰；B對照組術后第3d見大量脂肪細胞凋亡，脂肪組織溶解；C脂聯素干預組術后第5d見少量脂肪細胞凋亡，脂肪組織結構清晰；D對照組術后第5d見中等脂肪細胞凋亡，脂肪組織結構紊亂。

表2 兩組之間脂肪細胞凋亡數目的比較（n＝35）

2．3 電鏡觀察豬ATWH中脂肪細胞凋亡的變化

分別于術后第3d及第5d應用電鏡觀察豬ATWH中細胞凋亡差別。電鏡結果提示，兩組脂肪細胞之間都存在細胞凋亡的表現；第3d和第5d對照組的凋亡程度及范圍遠遠高于脂聯素干預組。見圖2。

圖2 A脂聯素組術后第3d見線粒體結構腫脹，細胞核結構完整；B對照組術后第3d見細胞核膜破裂，核質濃縮，細胞已發生不可逆凋亡；C脂聯素術后第5d見胞漿線粒體腫脹好轉，細胞結構完整；D對照組術后第5d見胞漿結構不清晰，無法區別細胞器結構。

3 討論

切口愈合一直是國內外研究熱點，但主要集中在疤痕、糖尿病創面模型、血管生成、干細胞、炎癥反應等［9－21］。針對ATWH過程中出現的各種問題的研究還未起步；對于脂聯素促進ATWH過程中的分子機制尚未見報道。在本實驗研究之前，課題組進行了大量臨床隨機對照試驗，通過改良手術操作細節，提高ATWH等級，仍無法達到理想的愈合效果。說明ATWH過程極其復雜，ATWH的機制未完全闡明。

近年來，脂聯素是國內外的研究熱點。大量文獻報道，脂聯素具有抗炎、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化和增敏胰島素的作用。但脂聯素與ATWH的關系尚未見報道。本實驗首次觀察到脂聯素明顯促進ATWH，脂聯素的表達水平與脂肪細胞的凋亡率呈負相關，此研究結果為初步闡明脂聯素促進ATWH的機制奠定了堅實基礎。但迄今為止，脂聯素兩種受體在信號傳遞過程中的具體作用現在仍不清楚，這是一個非常值得進一步研究的問題。

另外，本實驗證實脂聯素可以抑制脂肪細胞凋亡，但是其介導細胞凋亡的具體通路仍然未知［11］。這些將指引我們在前期研究的基礎上，繼續全面深入地研究脂聯素在ATWH中的抗凋亡作用及機制，并在臨床實踐中驗證基礎研究結論，為將脂聯素應用到臨床手術切口并發癥的防治中提供依據。

［1］Jeon IH，Morrey BF，Anakwenze OA，et al．Incidence and implications of early postoperative wound complications after total elbow arthroplasty［J］．J Shoulder Elbow Surg，2011，20（6）：857．

［2］Inotsume－Kojima Y，Uchida T，Abe M，et al．A combination of subcuticular sutures and a drain for skin closure reduces wound complications in obese women undergoing surgery using vertical incisions［J］．J Hosp Infect，2011，77（2）：162．

［3］Greco JA 3rd，Castaldo ET，Nanney LB，et al．The effect of weight loss surgery and body mass index on wound complications after abdominal contouring operations［J］．Ann Plast Surg，2008，61（3）：235．

［4］Fang S，Suh JM，Atkins AR，et al．Corepressor SMRT promotes oxidative phosphorylation in adipose tissue and protects against diet－induced obesity and insulin resistance ［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（8）：3412．

［5］Yang C，Xing X，Xu D，et al．Effects of adipose－derived stem cellshyaluronic acid composite on healing of wound combined with radiation injury［J］．Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi，2011，25（12）：1499．

［6］Kawada T，Hasegawa M．Predictive ability of serum high－molecular－weight adiponectin in combination with serum insulin and serum C－reactive protein for the presence of metabolic syndrome［J］．Ann Hum Biol，2012，39（2）：108．

［7］Ahonen T，Vanhala M，Kautiainen H，et al．Sex differences in the association of adiponectin and low－grade inflammation with changes in the body mass index from youth to middle age［J］．Gend Med，2012，9（1）：1．

［8］Goldstein B J，Scalia R．Adiponectin：A novel adipokine linking adipocytes and vascular function ［J］．J Clin Endocrinol Metab，2004，89（6）：2563．

［9］Dave S，Kaur NJ，Nanduri R，et al．Inhibition of Adipogenesis and Induction of Apoptosis and Lipolysis by Stem Bromelain in 3T3－L1Adipocytes［J］．PLoS One，2012，7（1）：e30831．

［10］Wu X，Yan Q，Zhang Z，et al．Acrp30inhibits leptin－induced metastasis by downregulating the JAK／STAT3pathway via AMPK activation in aggressive SPEC－2endometrial cancer cells［J］．Oncol Rep，2012Feb 2．doi：10．3892／or．2012．1670．［Epub ahead of print］

［11］南 華，高建華，魯 峰，等 脂肪組織來源干細胞促進軟組織愈合的實驗研究 ［J］．南方醫科大學學報，2010，30（20）：2633．

［12］何 勇，辛國華，曾逃方．脂肪組織促進創面愈合的機制 ［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（41）：7719．

［13］溫學輝，付小兵，孫同柱，等．保留不同厚度脂肪組織對豬燒傷創面收縮的影響 ［J］．感染·炎癥·修復，2007，8（1）：14．

［14］付小兵，程 飚，盛志勇．進一步重視脂肪新功能對創面愈合作用的研究 ［J］．中國修復重建外科雜志，2004，18（6）：447．

［15］Han S，Pan H，Zhang J，et al．Identification of a small molecule activator of novel PKCs for promoting glucose－dependent insulin secretion［J］．Cell Res，2011，21（4）：588．

［16］Huang H，Song TJ，Li X，et al．BMP signaling pathway is required for commitment of C3H10T1／2pluripotent stem cells to the adipocyte lineage ［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（31）：12670．

［17］Lu F，Li J，Gao J，et al．Improvement of the survival of human autologous fat transplantation by using VEGF－transfected adipose－derived stem cells［J］．Plast Reconstr Surg，2009，124（5）：1437．

［18］Liang GP，Su YY，Chen J，et al．Analysis of the early adaptive response of endothelial cells to hypoxia via a long serial analysis of gene expression ［J］．Biochem Biophys Res Commun，2009，384（4）：415．

［19］Ma CY，Ji T，Ow A，et al．Surgical site infection in elderly oral cancer patients：is the evaluation of comorbid conditions helpful in the identification of high－risk ones ［J］．J Oral Maxillofac Surg，2012Jan 19．［Epub ahead of print］

［20］Cheng B，Liu HW，Fu XB．Update on pruritic mechanisms of hypertrophic scars in postburn patients：the potential role of opioids and their receptors ［J］．J Burn Care Res，2011，32（4）：e118．

［21］Sun X，Fu X，Han W，et al．Dedifferentiation of human terminally differentiating keratinocytes into their precursor cells induced by basic fibroblast growth factor［J］．Biol Pharm Bull，2011，34（7）：1037．