急性動脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）水平的變化及臨床意義

劉曉陽，康春陽，韓瑩瑩，陳加俊，王立波，趙之恭

（吉林大學中日聯誼醫院 神經內科，吉林 長春130033）

患者發生急性心肌梗死后其外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）數量明顯減少，本研究測定了急性動脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）的水平并探討其在缺血性腦損傷中的臨床意義。

1 對象和方法

1．1 對象

收集2012年2－12月在吉林大學中日聯誼醫院神經內科住院的急性期腦梗死患者和同期住院健康體檢者78例。其中對照組30例，為同期住院健康體檢者，其中男性18例、女性12例，平均年齡56．60±5．96歲，均無吸煙及酗酒史、卒中家族史、冠心病、高血壓、糖尿病、血脂異常等腦血管危險因素。梗死組48例，為發病7天內的急性期腦梗死住院患者，其中男性33例、女性15例，平均年齡56．36±6．86歲。本研究所納入的急性期腦梗死病例均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準，并經病史、頭顱CT和（或）MRI頸部血管彩超及TCD檢查證實，入選病例均為發病7天內的住院病人，且近2個月內未服用應用炎癥抑制藥物如非甾體類抗炎藥、類固醇、免疫抑制劑及鴉片類藥物等可影響外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）水平的藥物。排除標準：①血液系統及自身免疫性疾病、全身活動性感染者；②近3個月患急性心肌梗死、血管閉塞性疾病，心源性腦栓塞和腦出血史者；③嚴重心、肝、腎功能不全及代謝性疾病者；④近3個月內有外科手術、炎癥、腫瘤及輸血等影響CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）水平的患者；⑤嚴重的其他系統疾病者。

1．2 方法

1．2．1 評價標準 依據美國國立衛生研究院卒中量表（NIH Stroke Scale，NIHSS）進行神經功能缺損評分：0－15分為輕度神經功能缺損組、16－30分為中度神經功能缺損組、31－45分為重度神經功能缺損組；依據Pullicino公式（長×寬×CT或MRI掃描陽性層數／2）計算梗死病灶體積，并分為小、中、大灶三組，＜5cm3為小灶組，5－10cm3為中灶組，＞10cm3為大灶組；經頸動脈血管超聲證實有頸動脈粥樣硬化（CAS），根據彩色多普勒超聲儀檢測結果，動脈內膜光滑、IMT＜1．0mm者為正常頸動脈，1．0mm≤IMT＜1．5mm為頸動脈內膜增厚，IMT≥1．5mm且增厚的內膜向管腔內凸出為有粥樣斑塊形成，動脈管腔狹窄率≥50%者認為存在動脈狹窄。根據病變程度分為三組：頸動脈內膜增厚組（A亞組）19例，頸動脈斑塊組（B亞組）15例及頸動脈狹窄組（C亞組）14例。

1．2．2 標本采集及檢測方法 入院后次日清晨空腹采集肘靜脈血2ml，標本采集后置于抗凝真空管中，并存放于室溫下。新鮮樣本3小時之內進行樣本處理。取2支FCM試管，分別標記為染色管和對照管，均加入100μl抗凝血，染色管中加入CD4－PE和CD25－FITC各10μl，對照管加入CD4－PE和IgG1－FITC各10μl，充分混勻室溫避光孵育15分鐘；加入紅細胞裂解液500μl于兩支試管中，充分混勻室溫避光4℃避光孵育10min，加入PBS液500μl于兩支試管中，混勻，以1 500r／min離心5 min，棄去上清液，加入PBS液500μl重懸后，上機檢測；用CXP－cytometer軟件獲取和分析10000個細胞，在側向角散射光參數點圖上對淋巴細胞群設窗，收集細胞數共10000個，以此群體統計CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）的百分比。

1．3 統計學方法

采用SPSS17．0統計軟件進行統計分析，所用數據均行正態分布檢驗，正態分布的計量資料采用均數±標準差（ˉx±s）表示；兩組間比較采用t檢驗，多組間比較應用方差分析，兩兩比較采用LSD法；P＜0．05為差異有統計學意義，P＜0．01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2．1 梗死組不同神經功能缺損程度患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）水平比較 梗死組不同神經功能缺損程度患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比均較對照組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0．05）；其中，重度組外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比低于中度組，中度組外周血CD4＋CD25＋調節性 T細胞（Treg）百分比低于輕度組，差異均有統計學意義（P＜0．05）（見表1）。

表1 梗死組不同神經功能缺損程度患者外周血Treg水平比較（%，xˉ±s）

2．2 梗死組不同梗死病灶體積患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）水平比較 梗死組不同梗死病灶體積患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比均較對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0．05）；其中，大灶組外周血 CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比低于中灶組，中灶組外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比低于小灶組，差異均有統計學意義（P＜0．05）（見表2）。

表2 梗死組不同梗死病灶體積患者外周血Treg水平比較（%，xˉ±s）

2．3 梗死組不同頸動脈粥樣硬化程度患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）水平比較 研究結果顯示，頸動脈內膜增厚組（A亞組）、頸動脈斑塊組（B亞組）、頸動脈狹窄組（C亞組）三組患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比均較對照組降低，表明急性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）水平隨CAS程度的加重而降低。其中，C亞組外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比低于B亞組，B亞組外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比低于A亞組，差異均有統計學意義（P＜0．05）（見表3）。

表3 梗死組不同CAS程度患者外周血Treg水平比較（%，xˉ±s）

2．4 外周血Treg水平與頸動脈內－中膜厚度（IMT）比較 本研究還發現外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比與頸動脈IMT值有相關性，即外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比與頸動脈內－中膜厚度（IMT）呈顯著負相關（r＝－0．543，P＜0．01）（見表4）。

表4 外周血Treg水平與頸動脈內中膜厚度（IMT）比較（%，ˉx±s）

3 討論

動脈粥樣硬化性腦卒中呈年輕化趨勢，發病率及死亡率逐年增高，嚴重威脅著人類的健康［1］，而動脈粥樣硬化本身及繼發于動脈粥樣硬化病變基礎上形成的腦梗死都存在炎性免疫反應［2－4］，甚至認為，過度表達的局部炎性反應對缺血區腦組織的損傷要比缺血本身更嚴重，抑制其后過度表達的炎性反應，調節致病性T細胞（Tp）和免疫調節性T細胞（Tr）等的動態平衡，已成為當今治療動脈粥樣硬化性腦梗死的重要靶點［5］。國內外已有大量文獻報道，CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）作為一類新型的免疫調節性T細胞，在急性心肌梗死后其外周血數量明顯減少［6，7］。

本研究顯示：梗死組不同神經功能缺損程度患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比均較對照組顯著降低。不同梗死病灶體積患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比均較對照組明顯降低。神經功能缺損評分的高低及梗死體積的大小往往代表著腦梗死的嚴重性，兩者均與急性動脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）水平呈負相關。表明外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）數量關系到早期缺血性腦卒中的嚴重程度，提示其可作為反映缺血性腦損傷嚴重程度的敏感指標。這種相關性變化的機制復雜，可能為多重原因所致CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）生成減少，消耗增多及自身凋亡等免疫調節失衡所致。有待于進一步實驗觀察及臨床研究。

本研究還發現外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）百分比與頸動脈內－中膜厚度（IMT）呈顯著負相關。機制可能為：①生成減少，動脈粥樣硬化形成及加重的過程伴隨著氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）的生成［8－10］，血管內皮細胞的破壞［11］，單核細胞的侵潤，CD4＋T細胞更傾向于分化為Th1細胞，活化的Th1細胞會分泌致炎因子，此時機體異常激活狀態的免疫反應抑制外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）的生成，使其數量逐漸減少。②消耗增多，CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）能抑制內皮細胞分泌炎性因子的表達［11］，抑制受損內皮細胞的抗原遞呈功能［11］，促進外周血內皮祖細胞（EPCs）增殖、遷移、黏附，而血管內皮細胞功能受損是動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）發生發展的重要環節［12］，所以持續的內皮損傷和功能障礙會導致外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）過度消耗甚至衰竭；③自身凋亡，動脈粥樣硬化進展的過程伴隨著氧化應激的逐漸加重，氧化應激可促進細胞凋亡，國內外研究表明CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）對誘導凋亡特別敏感，使其凋亡增加，使外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）更加減少。他汀類藥物具有抗氧化應激作用，可能就是通過抑制外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）的凋亡，從而發揮抗動脈粥樣作用。Xue Keying等通過動物實驗研究表明丹參注射液可以通過促進外周血CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）的產生，抑制效應性CD4＋T細胞尤其是Th1細胞及其分泌致炎因子的活化而揮抗炎及免疫調節作用［13］。

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