兒童再生障礙性貧血骨髓間充質干細胞GATA－2基因表達的研究

王 玥，薛 露，馬 翠，何永艷，孫鴻雁，李春懷

（吉林大學第一醫院 小兒血液腫瘤科，吉林 長春130021）

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）發病機制復雜，通常被認為是免疫介導的造血功能衰竭，先前的研究證實AA患者存在免疫細胞及分子異常導致的造血干細胞及骨髓 MSC的功能損傷［1，2］，導致紅骨髓總容量減少，代以脂肪髓，臨床以全血細胞減少為主要表現的一組綜合征。

GATA－2為轉錄因子GATA家族成員，亦屬鋅指結構家族，可識別和結合靶基因的特異性［T／A（GATA）A／G］序列并因此得名。在早期造血干／祖細胞及 MSCs中均有表達，并調節其增殖、分化［3，4］，是調節正常造血重要的轉錄因子，過去關于GATA－2與AA相關機制的研究主要集中于GATA－2表達下調對造血干細胞的影響［5］，而很少有報道骨髓造血微環境中骨髓MSCs的GATA－2表達情況。為了探討GATA－2在AA兒童治療前后骨髓MSC的表達水平變化及其在AA發病機制中可能的作用，我們采用QRT－PCR法對38例AA患兒和20例正常對照組骨髓MSC GATA－2表達進行檢測。

1 材料和方法

1．1 研究對象

2008年10月至2011年10月在吉林大學第一醫院小兒血液科收治的38例AA患兒均為重癥AA，所有病例均經過外周血象、骨髓象、骨髓活檢，符合再障診斷標準及分型標準［6］。其中男20例，女18例，年齡2－13歲，平均7歲。正常對照組20例來自于骨髓細胞形態學檢查正常的非血液病患兒，其中男9例，女11例，年齡2－12歲，平均5歲。38例患兒中30例接受免疫抑制治療（環孢素、雄激素），其中7例曾應用ATG治療，療效評價按照1987年第四屆全國再生障礙性貧血學術會議修訂的療效標準［7］，對治療有反應組包括為療效基本治愈、緩解、明顯進步的患兒，22例獲得治療2年骨髓標本，8例失訪，12例患者獲得緩解。患者及正常志愿者對試驗方案均知情同意，并經醫院倫理委員會批準后收集經肝素抗凝的骨髓液4ml。

1．2 主要試劑及儀器

淋巴細胞分離液（天津TBD公司）；DMEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶 （Hyclone公司）；Trizol試劑、所有引物（Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒和熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒（日本TaKa－Ra公司）；流式細胞儀 （Becton Dickinson Biosciences公司）；熒光標記小鼠抗人抗體（BD公司）。

1．3 MSC的培養

取髂后上棘部位骨髓液4ml（肝素抗凝），用Ficoll淋巴細胞分離液（密度1．077）按密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞。把1×107單個核細胞／ml加入細胞培養體系中［MesenCult Basal Medium，包括人間充質干細胞富集試劑］，在25cm2的塑料培養瓶（CELLSTAR，Germany），于培養箱（37℃、5%CO2及飽和濕度）中培養。培養48h棄去培養液上清加入培養液繼續培養。當貼壁細胞達80%瓶壁面積，用適量PBS液沖洗，以0．25%（w／v）胰蛋白酶溶液消化貼壁細胞。將消化的貼壁細胞計數，根據細胞數分瓶繼續培養。第3代MSC用于后續試驗。

1．4 MSC的鑒定

FACS Caliber流式細胞儀檢測MSC免疫抗體表達。第3代MSC胰蛋白酶消化沖洗后，1×105細胞加入5μg單克隆抗體，4℃，30min。以PBS（含1%胎牛血清）沖洗細胞，重懸于300μl PBS液中待檢。采用流式細胞儀檢測第3代MSCs表面標志CD29，CD44，CD45，CD34，CD90，CD105表達水平。熒光標記小鼠抗人抗體購于BD公司，以同型IgG作為陰性對照，結果用CellQuest軟件分析。

1．5 RNA提取和cDNA合成

總RNA的提取：選擇生長狀態較好的3代MSCs和 AA－MSCs，按每105－106個細胞加入 Trizol裂解液1ml，裂解后加入0．2ml氯仿，離心后吸取上清，加入0．5ml異丙醇，離心沉淀后棄上清，體積分數75%乙醇洗滌沉淀，最后加入適量1g／L DEPC處理過的無菌雙蒸水溶解RNA。cDNA反轉錄合成：反轉錄反應體系為20μl，包括標本RNA 1μg，隨機引物100ng和反轉錄酶等。

1．6 引物設計與合成

從美國生物技術信息中心（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov）的 Genbank數據庫中檢索 GATA－2基因 （ACCESSION M77810）和 GAPDH 基 因（HS99999905＿m1）的 mRNA序列。參照文獻［8］中的引物序列設計上下游引物，并運用美國Whitehead生物醫學研究所基因組研究中心（http：／／www．genome．wi．mit．edu）提供的Primer3程序設計探針，由上海基康生物技術有限公司合成Taqman熒光探針。在ABI 7300實時定量PCR儀上進行實時定量擴增。

1．7 實時定量PCR

為保證PCR擴增的有效性及分析的準確性，從AA患者及正常人 MSCs中提取總RNA，反轉錄合成cDNA，進行GATA－2和GAPDH的實時擴增并得到 Ct值，Ct值（cycle threshold）即 PCR 擴增過程中熒光信號開始由本底進入指數增長期的拐點所對應的循環次數，基因表達量的計算方法采用上海基康生物技術有限公司提供的標準品進行計算待測樣本中基因表達量。PCR循環條件參見說明書。

1．8 統計學分析

實驗數據用 Mean±SD表示，各個組間GATA－2／GAPDH比例采用t檢驗。采用 SAS 9．1統計軟件進行統計分析，P＜0．05為差異有顯著性。

2 結果

2．1 細胞形態學觀察結果

骨髓中分離MSCs接種于培養瓶中，24h后即可觀察到少量貼壁細胞生長，48h后去除懸浮細胞，貼壁細胞表現為成纖維細胞樣，原代細胞形態不均一，第3代細胞鋪滿瓶底后呈長梭形、漩渦狀分布，形態均一（圖1）。

2．2 MSCs的表面標志

比較AA患者MSCs與正常人MSCs的表面標志，結果顯示兩者無明顯差異，均不表達CD34，CD45，表達CD29、CD90、CD105及CD44（圖2）。

圖1 骨髓間充質干細胞（MSC）（×100）

2．3 再生障礙性貧血患者和正常人MSCs中GATA－2基因的表達水平比較（圖3）

來自于AA兒童和正常對照組骨髓MSC傳代至第三代時，經實時定量PCR檢測GATA－2基因表達。AA兒童治療前 MSC GATA－2基因表達水平與正常對照相比，明顯減低（P＜0．05）；免疫抑制治療2年后對免疫抑制治療有反應的AA兒童GATA－2表達水平高于發病時，且與正常對照組表達水平無統計學差異（P＞0．05）。對免疫抑制治療無反應的AA兒童GATA－2表達水平低于于發病時和正常對照組GATA－2表達水平（P＜0．05）。

圖2 骨髓間充質干細胞（MSC）表面標志

圖3 再生障礙性貧血患者免疫治療前后和正常人間充質干細胞中GATA－2基因的相對表達量比較

3 討論

骨髓MSCs是造血微環境的主要成分，具有自我更新及增殖能力，通過介導造血干細胞（hematopoietic stem cells HSCs）的黏附，分泌多種造血生長因子而發揮造血支持作用［9，10］，且具有調節免疫及維持免疫穩態的作用。多項研究證實AA患者骨髓 MSCs存在生物學性質異常［11，12］，例如增殖能力的下降，易于分化形成脂肪細胞等。

GATA－2是調節正常造血的重要轉錄因子之一，其穩定和平衡對于維持正常造血十分重要，在正常的造血過程中，隨著造血細胞的分化及成熟，GATA－2的表達下調可以阻止正常造血細胞的增殖和分化［13，14］。過去關于轉錄因子 GATA－2與 AA 的發病機制的研究主要從造血干細胞方面著手，近年來隨著骨髓MSCs分離及培養技術日益成熟，少數研究者開始關注AA患兒骨髓 MSCs的GATA－2表達情況，我們前期研究發現AA患兒病初MSCs中 GATA－2表達明顯低于正常［16］，這與文獻［15］報道一致，提示GATA－2的異常表達在AA的發病機制中發揮重要作用。為進一步證實GATA－2的表達變化在兒童AA的發病機制中作用，本文從轉錄水平上研究了AA患兒治療前后骨髓MSCs中GATA－2基因表達變化情況。

研究結果表明AA患兒病初GATA－2基因表達水平明顯低于正常兒童，且經免疫抑制治療2年后，對免疫治療有反應的患兒該基因表達水平較前明顯提高，且治療后該基因表達水平與正常對照組表達水平無統計學差別（P＞0．05）；而對免疫治療無反應的患兒該基因表達水平較病初無明顯變化，這一研究結果提示AA患兒體內的GATA－2基因表達異常參與發病過程及與AA患兒體內免疫異常密切相關。

GATA－2在早期造血干／祖細胞中表達，隨著造血細胞分化、發育成熟，GATA－2表達下調。GATA－2在體內的表達有嚴格的“劑量依賴”效應，GATA－2的表達下調對細胞分化是必需的［18］。正常人骨髓中有GATA－2的低表達，在各類白血病患者中，GATA－2的表達增高。GATA－2在白血病中的高表達反映了造血干／祖細胞分化、發育阻滯，幼稚白血病細胞增多。反之，AA患兒骨髓造血干細胞和間充質干細胞中GATA－2表達均下調，提示兩者增殖、分化能力下降，支持AA的造血干細胞數量和功能缺陷理論。

轉錄因子GATA－2可通過調節脂肪細胞特異性基因表達而調節脂肪細胞分化，其表達下降可導致脂肪細胞分化加速，脂肪細胞形成增多［4］，文獻［16，17］研究表明AA患者 MSCs體外培養過程中易于向脂肪細胞分化，上述結果均支持臨床中AA患兒骨髓脂肪化這一事實。

另外，本研究表明對免疫抑制治療有效的患兒治療后GATA－2表達較病初明顯升高，而治療無效的患兒該基因表達較發病時無明顯變化，提示GATA－2基因表達異常與AA患兒體內免疫異常密切相關。IFN－γ在AA的免疫異常中發揮重要作用，我們前期研究發現AA患兒發病時PPARγ表達升高，且IFN－γ抑制GATA－2的表達，AA患兒經過免疫抑制治療后GATA－2表達升高，此時是否存在PPARγ表達的降低，這一點尚需進一步證實。且IFN－γ與GATA－2之間的關系及作用機制尚需進一步研究。

總之，本研究發現了GATA－2基因在AA患者MSCs的表達明顯低于正常人MSCs的表達，其差異有顯著性意義，且經免疫治療效果好的患兒該基因表達水平與正常人無明顯差異，提示在AA發病機制的微環境改變中除MSCs的免疫異常外，GATA－2基因通過其與MSCs的相互作用也參與了對微環境的調控，這為了解MSCs在造血因子和成脂調控中的作用提供了進一步的證據，其相互作用關系及具體調控機制尚待進一步研究。

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