響應面法優化鴨胸肉鹽溶蛋白的提取工藝

王 偉，汪夢非，姚 遙，姜發堂，肖 滿，倪學文

（湖北工業大學輕工學部食品與制藥工程學院，湖北武漢430068）

肌肉鹽溶蛋白占肌肉的70%～90%，是影響肉蛋白凝膠功能特性的主要肌肉蛋白，直接影響肉制品的組織特性、保水性、黏結性和產品得率[1]，因此鹽溶性蛋白的性能決定肉制品的最終品質[2]。鹽溶蛋白是肉糜形成彈性凝膠的主要成分之一，在制備肉糜﹑重組肉等其他產品過程中，鹽溶蛋白的浸出率對后序加工、制品的品質有著舉足輕重的作用。鹽溶蛋白的高浸出率，有利于改良肉糜的質構，提高肉的加工性能。目前肉制品如在火腿的的滾揉工序中，其主要目的就是使鹽溶蛋白盡可能多的浸出。但對于鴨肉加工來說，滾揉對鹽溶蛋白的浸出影響不大，因此就要對其他條件進行研究[3]。白艷紅等[4]利用響應面優化法研究pH、NaCl、MgCl2和復合磷酸鹽（MP）對豬后腿肉鹽溶蛋白提取率的影響；丁寧等[5]采用響應面分析法對鯊魚鹽溶蛋白的提取條件NaCl濃度、pH和低溫加熱時間進行了優化；王莉莉[6]對鵝肉鹽溶蛋白質的提取條件進行了研究，確定了NaCl濃度、提取液pH、浸提時間3個因素的取值范圍；Boyer等[7]研究了離子強度對兔肉的鹽溶蛋白的影響；Shikha等[8]在研究了pH對鹽溶肉蛋白的影響后發現提高pH使鹽溶蛋白偏離其等電點，且而關于鴨肉鹽溶蛋白提取的研究報道較少。本文通過對鴨肉鹽溶蛋白提取過程中影響因素的分析，在單因子實驗的基礎上，應用響應面法（RSM）對鴨肉鹽溶蛋白的提取條件進行優化，提高鴨肉鹽溶蛋白的提取率，得到最佳的鹽溶蛋白提取工藝，為鴨肉的進一步綜合開發和合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨胸肉選自湖北本地的荊江麻鴨 武漢南湖中商超市冷凍鴨胸肉，屠宰期不超過一周；考馬斯亮藍G250、牛血清蛋白 湖北晶茂生物科技有限公司；NaCl 分析純，山東萊陽市雙雙化工有限公司。

GL-52型高速冷凍離心機 湖南長沙平凡儀器儀表有限公司；BP221S型電子分析天平 德國Sartorius公司）；DS-1型組織搗碎機 浙江金壇市華龍實驗儀器廠；FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV 1900型紫外可見分光光度計 上海荊和分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 預處理 鴨胸肉剔除筋鍵、脂肪后，切成小塊裝于保鮮袋，-18℃以下凍藏，使用前于4℃下解凍。

1.2.2 鴨肉鹽溶蛋白的提取 根據DeFreitas[9]和Bertram[10]的方法，并略作改進如下：鴨肉與一定濃度的鹽溶液按比例倒入組織搗碎機攪成肉漿狀，4℃靜止一段時間后，以12000×g在4℃下離心30min，上清液用3層濾布過濾，去離子水稀釋至鹽濃度小于0.1mol/L，離心收集上清液，然后用去離子水稀釋上清液，重復上述過程，得到的上清液即鹽溶蛋白溶液。

1.2.3 鴨肉鹽溶蛋白的測定 參考王孝平等[11]考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 浸提時間對鹽溶蛋白提取量的影響 在鹽濃度0.5mol/L、固液比1∶4、浸提溶液pH7.5條件下，實驗分五個水平，提取時間分別為1、5、10、15、20h。提取鹽溶蛋白后，每組分別取1.0mL，測其蛋白濃度。

1.2.4.2 NaCl濃度對鹽溶蛋白提取量的影響 在pH=7.0，固液比1∶4，提取時間10h的條件下，研究0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/L的氯化鈉溶液對提取鹽溶蛋白的影響。提取鹽溶蛋白后，每組分別取1.0mL，測其蛋白濃度。

1.2.4.3 固液比對鹽溶蛋白提取量的影響 在鹽濃度0.5mol/L、浸提時間10h、浸提溶液pH為7.5條件下，實驗分五個梯度，固液比（g/V）分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。提取鹽溶蛋白后，每組分別取1.0mL，測其蛋白含量，然后根據固液比例乘以稀釋倍數得到每組的蛋白總量。

1.2.4.4 浸取溶液的pH對鹽溶蛋白提取量的影響 肌肉蛋白質的等電點在pH5.5～6.0時肌肉蛋白的提取對pH較為敏感。根據文獻資料，肉類鹽溶蛋白提取pH通常在6.0～8.5之間，因此選取pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，固定鹽濃度0.5mol/L、固液比1∶4、浸提時間10h。

1.2.5 響應面（RSM）實驗設計 根據Box-Behnken中心設計原理，以NaCl濃度、浸提溶液pH、固液比、浸提時間四個因素為自變量，并以-1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平，以鴨肉鹽溶蛋白提取率為響應值，設計4因素3水平實驗，設計27個實驗點，其中24個析因點，3個零點，實驗因素見表1。

表1 響應面實驗因素水平Table 1 The levels and factors of response surface experimental

1.2.6 數據統計 每次實驗設3個平行，取平均值。數據采用SAS 9.2軟件進行統計分析[12-14]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗及分析

2.1.1 浸提時間對鹽溶蛋白提取量的影響 由圖1分析可知，在NaCl濃度、浸提溶液pH、固液比不變的情況下，0～5h蛋白含量曲線的斜率最大，說明此時溶液中蛋白浸出速度快。這是因為溶液中蛋白含量低，肉中的蛋白含量高，滲透壓大，蛋白迅速向溶液中擴散；5～10h，隨時間的延長，溶液中蛋白含量增加的速度有所減緩（p＜0.05），這是因為經過一段時間的擴散，肉和溶液中的蛋白濃度差縮小，滲透壓減小所致[15]；10h后，溶液中的蛋白濃度接近肉中的蛋白濃度，鹽溶蛋白已基本溶出。如果時間過長，蛋白質的性質會發生變化，細菌也會大量滋生，不利于后期實驗，綜合考慮，10h是比較合理的浸提時間。

2.1.2 NaCl濃度對鹽溶蛋白提取量的影響 由圖2可以看出，鹽濃度在0.1～0.5mol/L時，蛋白含量隨著鹽濃度的提高而增加；在0.5～0.9mol/L，蛋白濃度隨著鹽濃度的升高而降低。這是因為鹽濃度能夠改變氨基酸側鏈的電荷分布，改變鹽溶蛋白在溶液中的存在狀態，使蛋白質和蛋白質的相互作用降低或增加，進而影響其溶解性。因此，鹽濃度0.5mol/L是較優的選擇。

2.1.3 固液比對鹽溶蛋白提取量的影響 在圖3中，在固液比為1∶2時，由于提取液太粘稠，在高速離心下無法分層，從而無法測定。固液比1∶3～1∶5時，蛋白質的總含量隨著固液比值的減小而顯著增加（p＜0.05），但到1∶6時，蛋白總量增加較少。考慮到固液比值太小，對下一步驟離心過程的影響，所以固液比選擇1∶5。

2.1.4 浸取溶液的pH對鹽溶蛋白提取量的影響 保持NaCl濃度等其他因素不變，在浸提溶pH6.0～7.5，蛋白質提取率呈上升趨勢，而在pH7.5～8.5，蛋白質提取率逐漸下降。原因是蛋白質分子既含有酸性基團，又含有堿性基團，高pH使鹽溶蛋白質偏離其等電點，蛋白質分子帶有同種電荷，互相排斥，蛋白質與蛋白質的相互作用減弱，而蛋白質和水之間的相互作用則加強，導致蛋白質的溶解度變大，溶液中的蛋白含量增加，但過高的pH會引起蛋白質變性，而且在堿性條件下也不利于防腐，綜合考慮，浸提溶液的pH選擇7.5。

2.2 響應面設計及結果

通過對實驗結果進行響應面分析，所選用的二次多項模型具有高度的顯著性（p＜0.0001）。經過二次回歸擬合后，得出擬合方程式為：

Y=18.7+0.875X1+1.316667X2+1.016667X3+3.841667X4-0.791667X12-0.175X1X2-0.275X1X3-0.075X1X4-2.654167X22+1.1X2X3-0.625X2X4-2.029167X32-0.375X3X4-2.766667X42。其中復相相關系數R2=96.21%，修正決定系數為91.79%，說明該模型能解釋91.79%響應值的變化，僅有總變異6.51%不能用此模型來解釋，所以該模型擬合程度良好，用該模型對鴨肉鹽溶蛋白提取工藝進行優化是合適的。

表2 實驗設計及響應值結果Table 2 Experimental design and response value

表3 方差分析Table 3 The analysis of anova

圖5 浸提溶液pH、浸提時間、溶液NaCl濃度、固液比交互影響提取率的曲面圖Fig.5 The surface chart of extraction solution pH，extraction solution concentration of NaCl，material to water ratio，extraction-duration

方差分析表明（表3），X2、X4、X22、X32、X42對蛋白提取率的影響極顯著（p＜0.001），表明在提取鴨肉鹽溶蛋白的過程中，NaCl濃度、浸提溶液pH、固液濃度的平方項、固液比的平方項、浸提溶液pH的平方項對鹽溶蛋白提取的影響極顯著（p＜0.01）。X1、X3、X2X3影響顯著（p＜0.05），即在提取過程中，浸提時間、固液比、NaCl濃度和固液比的交互作用對提取率的影響顯著（p＜0.05）。

根據回歸方程，作出響應面立體圖，見圖5。從圖5（a）～5（c）可以看出，保持其他因素不變，蛋白質提取率隨著浸提時間先上升，然后達到穩定。保持浸提時間不變時，隨著NaCl濃度的增加，蛋白質提取率先增高后降低。隨著固液比的比例增大，蛋白質提取率上升后趨于平穩。其中，由圖5（c）可以看出，保持浸提時間不變，蛋白質提取率隨著pH的上升而先上升后下降，這是因為提高pH使鹽溶蛋白偏離其等電點，使蛋白質的凈電負荷增加，造成蛋白質和蛋白質的相互作用減弱，和水的相互作用增加，蛋白質的溶解度增大，鹽溶蛋白提取充分；但過高的pH會使蛋白質變性。本研究結果與Shikha等[8]的研究一致。圖5（d）顯示在固液比不變的情況下，隨著NaCl濃度的增加，蛋白質提取率先增高后降。圖5（e）可知，保持pH不變，隨著NaCl濃度的上升，鹽溶蛋白提取率先上升后下降，因為NaCl濃度能夠改變氨基酸側鏈的電荷分布，進而影響其溶解性，對蛋白提取率產生顯著的影響（p＜0.001）。由圖5（f）可知，相比固液比，浸提溶液pH對蛋白質提取率有著明顯的影響，保持固液比不變，蛋白質提取率隨著pH的上升而先上升后緩慢下降。

以上4個因素對鹽溶蛋白提取率的影響從大到小依次為：浸提溶液pH（X4）＞溶液NaCl濃度（X2）＞固液比（X3）＞浸提時間（X1），即浸提溶液pH和NaCl濃度對提取率的影響最為顯著。最佳提取工藝條件：浸提溶液pH7.65、NaCl濃度0.52mol/L、固液比1∶5.21、浸提時間12.31h，鴨肉鹽溶蛋白提取率的響應值為20.4%。

2.3 最佳條件的驗證實驗

考慮到實際的可操作性，將以上最佳條件修正為浸提溶液pH7.7、NaCl濃度0.5mol/L、固液比1∶5.2、浸提時間12.3h，在此條件下進行三次實驗，得到鴨肉鹽溶蛋白提取率的平均值為19.9%，與理論值接近，說明采用RSM法優化得到的提取工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3 結論

本實驗在單因素實驗的基礎上通過響應面法優化鴨肉鹽溶蛋白提取實驗，以鴨肉鹽溶蛋白提取率作為響應值，設計了四因素三水平的響應面實驗。實驗結果表明浸提溶液pH、NaCl濃度、NaCl濃度的平方項、固液比的平方項、浸提溶液pH的平方項對蛋白提取率的影響極顯著（p＜0.001），并得到鴨胸肉鹽溶蛋白的最佳提取工藝條件：浸提溶液pH7.7、NaCl濃度0.5mol/L、固液比1∶5.2、浸提時間12.3h，鴨肉鹽溶蛋白提取率的響應值為20.4%，鴨肉鹽溶蛋白的實際提取率為19.9%，相對誤差為2.5%。本文為鴨肉鹽溶蛋白的提取提供了一定的指導。

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