A N N-G A法優化石吊蘭素提取工藝

張尊凱，侯 敏，權宇彤，曹家銘，董 媛，劉 艷

（吉林大學生命科學學院，吉林長春130012）

石吊蘭素是廣泛存在于苦苣苔科（Gesneriacee）吊石苣苔屬植物吊石苣苔（Lveicnotus pauciflorus Maxin）葉和花中的黃酮類物質[1]，又名巖豆素，內華依瓦菊素。石吊蘭素在植物體中以游離形式存在或與糖結合成甙的形式存在[2]。有顯著的抗結核桿菌、抗炎、降壓、清除自由基等多種生物學效應[3]。由于石吊蘭素化學結構上含有酚羥基，所以使其具有弱酸性[4]，進而對石吊蘭素的提取方法多是利用其物理化學特性。石吊蘭素不溶于水，微溶于甲醇、乙醇。2010版中國藥典中采用甲醇超聲提取石吊蘭素[5]，也有報道采用乙醇回流提取石吊蘭素[2]。而對于石吊蘭素提取工藝的研究卻非常少。盛衛國等采用正交設計優化了石吊蘭素的提取工藝[6]，不過正交實驗最終優化值只能是實驗所用水平的組合，不是非常準確。人工神經網絡（artificial neural network，ANN）和遺傳算法技術（genetic algorithm，GA）的發展，二者結合后，能夠很好的解決這一問題，也越來越多的用于各種生物學仿真建模和優化過程[7]。Guo等采用ANN-GA法優化了乳鏈菌肽發酵培養基，使乳鏈菌肽產量提高了8倍[8]。基于遺傳算法的神經網絡模型是以網絡節點模擬復雜的大腦神經細胞，同時模擬自然進化過程搜索最優解的方法，直接以逼近度（Da）作為評價指標，進行多元非線性分析[9]，比傳統的優化方法更直觀，適用性更廣。本文根據石吊蘭素的理化性質，在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken實驗設計和ANN-GA法考察了其最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石吊蘭全草 河北省安國市健仁藥材有限公司；石吊蘭素對照品 上海純優生物科技有限公司，純度大于98%；甲醇 色譜純；其余試劑 均為分析純。

TWCL-T型電熱套 鞏義市宏華儀器設備工貿有限公司；Agilent 1200 Series型高效液相色譜儀 廣州尚準儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 石吊蘭素的提取 取烘干至恒重的石吊蘭藥材粉20g，置圓底燒瓶中回流提取，加入一定體積的提取液煮沸，提取1～3h，并重復1～3次。合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，得樣品溶液。

1.2.2 HPLC法檢測石吊蘭素的含量[5]

1.2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAXSB-C18（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱，流動相：甲醇∶水（68∶32），檢測波長334nm，柱溫26℃，流速1.0mL/min，進樣量20μL。

1.2.2.2 對照品溶液制備 精密稱定石吊蘭素對照品適量，加甲醇制成25μg/mL的溶液，即得。

1.2.2.3 標準曲線的制備 分別取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，甲醇定容至5mL，混勻后HPLC測定石吊蘭素含量，并繪制標準曲線。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 乙醇濃度對石吊蘭素提取量的影響 稱取石吊蘭樣品適量，置圓底燒瓶中回流提取，按照固液比10∶1，加入體積分數濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇，煮沸，提取1h，重復兩次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，測定樣品中石吊蘭素含量。

1.2.3.2 提取時間對石吊蘭素提取量的影響 稱取石吊蘭樣品適量，置圓底燒瓶中回流提取，按照固液比10∶1加入95%乙醇，煮沸，分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h。重復2次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，得樣品溶液。

1.2.3.3 固液比對石吊蘭素提取量的影響 稱取石吊蘭樣品適量，置圓底燒瓶中回流提取，分別按照固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35加入95%乙醇，煮沸，提取1h，重復兩次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，測定樣品中石吊蘭素含量。

1.2.3.4 提取次數對石吊蘭素提取量的影響 稱取石吊蘭樣品適量，置于圓底燒瓶中回流提取，按照固液比10∶1加入95%乙醇，煮沸，提取1h，分別重復1、2、3、4次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定分別定容至25mL，測定樣品中石吊蘭素含量。差較大。但是，當隱含層節點數過多時，特別容易出現網絡過擬和現象[10]。而逼近度函數能很好的解決隱含節點和網絡的擬合情況。逼近度函數如下：

表1 BBD實驗因素水平表Table 1 Independent variables and their levels in the Box-Behnken design

式中，MSEc和MSEt分別是訓練集和測試集均方根誤差，nc和nt分別是訓練集和測試集數據個數，n是訓練集和測試集個數之和，c是常數（本文中c為1.2）。

1.2.6 GA優化 采用GA優化中適應度（Fitness）函數對最適ANN模型進行優化[9]，Fitness函數如下：

1.2.7 驗證實驗 為進一步確定最佳提取條件，根據ANN-GA預測的最佳提取條件進行實驗，測定石吊蘭素含量，重復5次，計算平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗優化石吊蘭素提取條件

以石吊蘭素濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.031X+0.19533，R2=0.9993。

2.1.1 乙醇濃度對石吊蘭素含量的影響 乙醇濃度與石吊蘭素提取量的關系如圖1所示。乙醇濃度對石吊蘭素提取有顯著影響，由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的提高，提取液中石吊蘭素的含量逐漸增加，當乙醇濃度為90%時達到最大值，此后，提取液中石吊蘭素含量下降，分析認為石吊蘭素的極性與90%濃度的乙醇最為接近，所以當乙醇濃度為90%時，其提取率最大。

1.2.4 Box-Behnken實驗設計 根據單因素實驗結果，采用4因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗設計，獲得最佳提取工藝，因素水平表見表1。

1.2.5 ANN模型的建立 通過Matlab 2010a軟件建立ANN模型[7]。ANN模型包括輸入層、隱含層和輸出層。以表2中提取條件為輸入值，以石吊蘭素含量為輸出值。并將輸入層隨機分成訓練集、校正集、測試集。隱含層對ANN模型的影響較大，一般情況下，隱含層節點數越多，ANN網絡模擬非線性的能力就越強，隱含層節點數過少，則網絡不能充分反映輸入節點與輸出節點間的復雜函數關系，從而導致測試誤

2.1.2 提取時間對石吊蘭素含量的影響 提取時間對提取液中石吊蘭素含量的影響如圖2所示。隨著提取時間的延長，提取液中石吊蘭素的含量逐漸增加，2h后，增加速度放緩，并在2.5h時，提取率達到最大，之后提取率隨著提取時間的延長略有下降，說明提取液中石吊蘭素接近飽和。所以選擇最適的提取時間為2.5h。

2.1.3 固液比對提取液中石吊蘭素含量的影響 固液比對提取液中石吊蘭素含量的影響的影響如圖3所示。固液比對石吊蘭素的提取影響不大，不過考慮到固液比值較小時，增加了石吊蘭素提取過程中的能耗和原料，不利于工業化生產，所以選擇最適的固液比為1∶15。

2.1.4 提取次數對提取液中石吊蘭素的影響 提取次數對提取液中石吊蘭素的影響如圖4所示，當提取次數為2次時，提取液中石吊蘭素含量最高，且含量不會隨著提取次數的增加而提高，說明提取2次時，石吊蘭中的石吊蘭素已經最大程度的提取出來，提取量并不會隨著提取次數增加而提高。所以選擇最佳的提取次數為2次。

2.2ANN-GA優化結果

按照Box-Behnken中心組合實驗設計進行實驗，實驗結果如表2所示。隨后，以表2中提取條件為輸入值，以石吊蘭素含量為輸出值。建立ANN-GA模型優化石吊蘭素提取含量。

表2 4因素3水平BBD實驗設計表格Table 2 The design matrix generated for the BBD and the obtained response values

逼近度函數Da能夠反映模型值和真實值的接近程度，所以Da值越大，則該隱含節點就越接近真實情況。由圖5可見，當隱含節點數為17時，Da達到最大值，所以選擇的ANN模型的隱含節點數為17。此時，模型的R2值為0.9853，表明ANN模型是顯著的。ANN模型建立后，采用GA優化該模型，由圖6可見，當進化至20代時，Fitness函數達到最低水平，且隨著進化代數的增加，Fitness并沒有增加。表明模型的擬合度是符合要求的。最終得到石吊蘭素最大提取率為2.395mg/g。此時，對應的石吊蘭素提取條件為：乙醇濃度84%，提取2.8h，固液比1∶17，提取2次。按照該條件進行5次驗證實驗，得到提取液中石吊蘭素含量為2.35mg/g，與預測值誤差為1.88%。與盛衛國等[7]優化的提取工藝相比，提取次數減少，提取時間有所延長，石吊蘭素的提取量顯著提高。可見，相比于正交優化法，ANNGA優化的模型擬合度更好，具有更好的優化能力。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，采用ANN-GA法優化了石吊蘭中石吊蘭素的提取條件，不僅最大程度上提高了石吊蘭素的提取率，同時也降低了能耗和成本。目前為止，關于石吊蘭素提取優化的報道還很少，本文為石吊蘭素在工業上的應用提供了研究基礎，具有很廣闊的應用前景。

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