TGF-β1和endoglin在乳腺癌發生發展過程中的表達及意義

王婭南 徐芳 李玉蘭 張順

乳腺癌是當今世界女性最多發的惡性腫瘤，自20世紀以來，國內外乳腺癌發病率無論是發達國家還是發展中國家，始終處于不同的上升狀態，乳腺癌其侵襲性和轉移性是導致腫瘤患者死亡的主要原因［1］。乳腺癌的發生、發展與血管生成密切相關，抑制血管生成成為治療乳腺癌的一個重要研究方向。血管的形成是一個復雜的過程，因而探討眾多因素中相互關系，有利于各種血管相關因子地位與主次之分，對于獲取有價值的干預靶位具有肯定價值。因此，本研究采用RT-PCR和免疫組織化學的方法檢測TGF-β1和endoglin mRNA和蛋白在乳腺正常組織、非典型性增生、原位癌及浸潤性癌組織中的表達變化，旨在討論兩者在乳腺癌發生發展過程中的作用，為進一步尋找關鍵靶位提供參考和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 取自2008至2010年我院病例，經由病理醫師復審病理切片。臨床資料和蠟塊保存完整，共210例，其中正常乳腺30例，非典型性增生50例，原位癌50例，浸潤性癌80例。病理分類依據世界衛生組織(WHO)2004年病理分型標準。

1.2 試劑 鼠抗人endoglin一抗，鼠抗人TGF-β1一抗，SP二抗試劑盒(北京中杉生物公司);Taq酶，dNTPs和引物(endoglin上游 引 物 5 ＇-CGCCGCCACATCAGAAGGCTG-3 ＇，下 游 引 物 5 ＇-CTTTGGTCCAGTCACACCTT-3＇，GAPDH 上游引物 5＇-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3＇，下游引物 5＇-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3＇，擴增子分別為805 bp，288 bp)，MMLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.3 實驗步驟

1.3.1 免疫組織化學染色：參照北京中杉公司SP兩步法進行免疫組織化學染色，所有切片均同一批完成，以保證實驗條件相同。陰性實驗對照：0.01 mol/LPBS代替一抗。

1.3.2 RT-PCR反應：①RT反應用M-MuLV RT酶為反轉錄酶，反應體系為 20 μl，37℃，1 h，70℃，10 min。 -20℃ 保存。②PCR反應：在反應體系中加入 cDNA 2.5μl，上下游引物(20 pmol/L)各 1 μl，總體系 25 μl。endoglin反應參數：94℃5 min，30 個循環(94℃45 s，58℃45 s，72℃ 1 min)，72℃7 min。GAPDH 反應參數：94℃5 min，30 個循環(94℃45 s，54℃45 s，72℃45 s)，72℃7 min。凝膠成像系統掃描照相并進行電泳條帶的分析，測量每一條帶的密度，并將其與內參(GAPDH)的吸光度相比，求相對的量。

1.4 統計學分析應用SPSS12.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗和相關分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Endoglin蛋白的陽性信號主要定位于新生的內皮細胞的胞漿，且新生血管分布不均勻，大多數局限于腫瘤實質邊緣的間質內。新生血管呈點、線、簇狀結構，有管腔樣結構形成，腔不規則，壁薄而無平滑肌形成。Endoglin蛋白在乳腺癌中的陽性表達率與患者年齡及腫瘤大小無關(P＞0.05)。Endoglin蛋白在正常組、不典型增生組、原位癌及浸潤性癌組的表達，兩兩比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1，圖1。

2.2 TGF-β1蛋白陽性表達主要定位于癌細胞胞質內，且在癌巢邊緣的癌細胞表達較強，大部分血管內皮細胞也有陽性表達。在正常乳腺組TGF-β1蛋白表達于少量血管內皮細胞;在非典型性組表達于異常增生的腺上皮細胞及新生的血管內皮細胞上。見圖1。

2.3 Endoglin mRNA在正常組、不典型增生組、原位癌及浸潤性癌組的相對表達量分別為(0.33±0.19)、(0.78±0.51)、(1.35±0.91)、(3.85±0.87)，兩兩比較，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見圖2。

2.4 不典型增生組、原位癌組及浸潤性癌組中TGF-β1與endoglin蛋白標記的MVD值及mRNA表達值有顯著相關性，TGF-β1蛋白表達陽性組中endoglin蛋白標記的MVD值及endoglin mRNA均顯著高于TGF-β1表達陰性組(P ＜0.05)。見表1。

3 討論

表1 不典型增生組和原位癌組及浸潤性癌組中TGF-β1與endoglin蛋白標記的MVD值相關性比較±s

表1 不典型增生組和原位癌組及浸潤性癌組中TGF-β1與endoglin蛋白標記的MVD值相關性比較±s

原位癌組(n=50) 26(+) 47.0±4.6 1.27±0.81 ＜0.05 24(-) 22.5±1.9 0.48±0.19浸潤性癌組(n=80) 56(+) 69.5±7.3 4.03±1.11 ＜0.05 24(-)29.8±5.0 0.68±0.13

圖1 免疫組化法TGF-β1與endoglin在乳腺浸潤性癌組織中的表達

圖2 endoglin的RT-PCR結果

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在我國乳腺癌發病率居我國女性惡性腫瘤的第1位，死亡率占我國女性死亡率的第3位。乳腺癌的病因學是多因素的，涉及飲食、生育和激素失衡等。腫瘤的生長與血管形成關系密切［2］。血管形成(angiogenesis)是指機體生長發育過程中或創傷修復、缺血缺氧和炎癥等情況下，原有微血管細胞(endothelial cell，EC)經過生芽、遷移、增殖與基質重建等形成新毛細血管的過程。腫瘤的生長可分為無血管期(avacular stage)或稱血管前期(prevascular stage)和血管期(vascular stage)。無血管期的腫瘤主要依靠周圍組織的彌散獲取營養物質和排泄代謝產物，腫瘤細胞處于休眠狀態，如果腫瘤細胞其增殖率和死亡率幾乎相等，腫瘤體積難以超過1～2 mm3，也極少發生轉移［3］。如果腫瘤超過這樣的體積還缺乏新生的毛細血管和小血管長入，腫瘤組織將發生退化，一旦新生血管長入腫瘤組織，腫瘤就形成的自身的血管系統，即進入了血管期。此期的腫瘤局部有大量的新生血管形成，腫瘤細胞得到充分營養供應，腫瘤組織就會不可控制性生長及無限制擴張趨勢，并向周圍組織浸潤，新生血管的基底膜不完整，血管通透性高以及新生血管的內皮細胞分泌膠原酶、纖溶酶和纖溶酶原激酶，在其作用下，腫瘤細胞極易穿透血管壁而發生周圍組織的浸潤和轉移。因此，血管形成在腫瘤發生、發展過程發揮著重要的作用，關于腫瘤血管形成的機制一直是目前研究的熱點問題。目前研究顯示，TGF-β1可能參與了血管的形成［4］。在TGF-β1基因缺失時內皮細胞分化發生缺陷，形成不了足量的內皮細胞管并且管腔不完整。本實驗發現TGF-β1蛋白在乳腺癌中的陽性表達率顯著高于正常組、不典型增生組;同時浸潤性癌組TGF-β1蛋白表達陽性率顯著高于原位癌組;并且，免疫組織化學結果顯示，TGF-β1蛋白陽性表達主要定位于癌細胞胞質內，且在癌巢邊緣的癌細胞表達較強，大部分血管內皮細胞也有陽性表達，而在正常乳腺組TGF-β1蛋白表達僅于少量血管內皮細胞呈現陽性表達;在非典型性組表達于異常增生的腺上皮細胞及新生的血管內皮細胞上，提示在乳腺癌發生過程中，癌細胞能夠合成TGF-β1，TGF-β1的陽性表達參與了乳腺癌的發生，可能是檢測乳腺組織癌變的分子標志物。但其具體機制，目前尚不清楚。Endoglin又名 CD105，分子量為180 kD，由兩個分子量為95 kD的單體組成的二聚體膜蛋白。Endoglin為內皮細胞上的一種抗原成分，與內皮細胞增生有關，對血管形成至關重要的。Miller等［5］通過檢測肺癌細胞株和各種類型的內皮細胞株中endoglin mRNA的表達，結果發現所有腫瘤細胞株均未檢測到endoglin mRNA，而所有的內皮細胞均表達一定數量的endoglin mRNA，這包括從肺癌組織中分離出來的內皮細胞，這一發現說明了endoglin選擇性的表達于內皮細胞。

在乳腺不典型增生、原位癌和浸潤癌組中，Endoglin mRNA及蛋白表達均與TGF-β1蛋白表達呈顯著正相關，提示Endoglin和TGF-β共表達參與了乳腺癌癌變過程，可能具有協同作用。惡性腫瘤的MVD與腫瘤的生長、轉移及預后有密切關系，腫瘤中血管的定量被認為是一種重要而獨立的預后指標［6］。

目前用于標記腫瘤組織微血管的試劑主要為泛血管內皮細胞標記物CD31、CD34抗體及FⅧ-RA等，但它們在腫瘤組織的活性增生性微血管中的表達有時并不穩定，因而在判斷MVD預后生存意義上存在差異。隨著乳腺良性病變向乳腺癌方向的發展，血管不斷形成和增生，血管密度也不斷增加，特別在MDC階段，說明一旦腫瘤細胞突破基底膜，瘤細胞更能刺激新生血管的生長，加速乳腺癌的浸潤和轉移［7］。乳腺癌發生侵襲、轉移導致患者預后不良，當出現轉移時，5年生存率由98%大幅下降至27%。如果在腫瘤發生時能控制早期癌，甚至是處在浸潤性癌前期病變時就能控制病程發展，將會帶來廣闊的控制、治療乳腺癌的前景。

1 Kim MS，You MK.Loquat(Eriqbotrya japonica)extracts suppress the adhesion，migration and invasion of human breast cancer cell line.Nutr Res Pract，2009，3：259-264.

2 田云霞，孟慶春，苑欣然，等.乳腺癌與相關危險因素的研究.河北醫藥，2012，34：1796-1797.

3 王純，盧宏達.乳腺癌綜合治療的臨床分析.中國全科醫學，2011，14：3756-3757，3760.

4 陳曉燕，陳清化，林榮威.乳腺癌組織中生存素的表達與生物學行為的關系.中國基層醫藥，2012，19：1391-1392.

5 Miller DW，Graulich W，Karges B，etal.Elevated expression of endoglin a component of the TGF-beta-receptor complex，correlates with proliferation of tumor endothelial cells.Int JCancer，2009，81：586-572.

6 Abdalla S，Behzad F，Bsharah S，etal.Prognostic relevance of microvessel density in colorectal tumours.Oncol Rep，2008，6：839-842.

7 張江宇，王欣，朱彩霞，等.CD105在乳腺癌發生發展過程中的表達的研究.中華腫瘤防治雜志，2007，14：1472-1474.