CD34和CD31與酪氨酸激酶在不同亞型腎癌中的表達及變化的意義

韓方征

目前，對實體腫瘤的研究已經成為熱點趨勢，尤其對腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)及受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)的研究［1］，其與腫瘤的生長發展直至轉移都密不可分，本文中所研究的不同亞型腎癌(renal cell carcinoma，RCC)，作為富血管腫瘤，MVD的研究尤為重要，研究表明，腎癌的發生與發展是一個階段性的，多因素的十分復雜的過程，腫瘤的生長產生促內皮細胞增殖因子不足的現象，因而內皮細胞出現快速增殖，新增生的內皮細胞可產生多種生長因子，從而促進受體RTK的產生，因其與本身特異性的結合，促使腫瘤血管新生［2，3］，并大量增加，因而對RTK的研究在臨床上也十分重要。本研究采用免疫組化SP法分析檢測CD34、CD31所標記的MVD值在不同亞型腎癌中的差異性，檢測RTK在不同亞型腎癌中表達之間的相關性，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2008年3月至2011年6月收治的128例腎癌患者為研究對象，整理患者術后標本，由專業病理醫師依據腎腫瘤病理診斷標準(世界衛生組織2004年制定)將其重新分級。128例患者中，男76例，女52例;年齡31～80歲，平均年齡(51.3±1.4)歲;其中腎乳頭狀癌33例，腎透明細胞癌66例，腎嫌色細胞癌29例，病理組織學分為3個級別，1級11例，2級41例，3級51例，4級25例，臨床分期也分為3階段，Ⅰ階段40例，Ⅱ階段31例，Ⅲ期30例，Ⅳ期27例，術前，全部患者未經化療、放療及免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 試劑選擇：選擇DAKO公司生產的CD34、CD31鼠抗人單克隆抗體，由美國 SANTA CRUZ生物技術公司［4］生產的RTK相關抗體，其中包括(兔抗人VEGFR-1多克隆抗體、兔抗人VEGFR-2多克隆抗體、兔抗人VEGFR-3多克隆抗體、兔抗人PDGFR-Q多克隆抗體、兔抗人PDGFR-B多克隆抗體、鼠抗人C-kit單克隆抗體)。免疫組化SP法試劑盒及(二氨基聯苯胺)DAB顯色試劑盒，選擇上海基因公司出品［5］。

1.2.2 檢測準備：①切片處理：使用洗潔精清洗載玻片，隨后做烤干處理，再使用清潔液行浸泡處理，時間約為24 h，再經流水充分沖洗后，送進烤箱烘干，經濃度為95%的乙醇浸泡約7～10 h后，經烤箱烘干處理后，可將經新鮮配置的防脫片膠涂在載玻片上，將每張玻片放入膠液中浸泡約40 s，再經丙酮溶液漂洗處理約10 s，漂洗共2次，將多余的膠液洗凈，最后送入烤箱進行烘干處理后備用。②石蠟切片：行常規切片處理，經輪轉式切片機4μm厚度進行切片，最后經展片與烤片等技術進行處理，再制作成石蠟切片，將組織切片放置于烤箱，烤箱溫度以65°左右為宜，保存約6 h備用。③染色處理：行HE染色處理，經15 min行2次二甲苯脫蠟處理，無水乙醇2次，乙醇溶液95%10 min處理，再經80%乙醇溶液10 min處理，5 min蒸餾水清洗，再放置于蘇木素染料中1 min，進行染色處理，取出自來水清洗，經濃度為1%的鹽酸乙醇進行分化，0.1%的氨水返藍，再水洗，經蒸餾水清洗后放置于伊紅染料中進行染色，最后再蒸餾水沖洗，使用中性樹膠封片。

1.2.3 檢測方法：CD34、CD31及RTK均應用免疫組化SP法檢測，具體步驟參照免疫組化SP試劑盒說明書，按照其上提供的具體步驟進行操作及染色處理。CD34及CD31在光鏡下顯示，染色陽性細胞呈現棕黃色，MVD值量化分析可采用Weidner提出的方法進行操作。RTK相關受體，其中包括血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)，血小板源性生長因子受體(platelet—derived growth factor receptor，PDGFR-α、PDGFR-β)，干細胞因子受體(“Kitten”，stem cell factor receptor，C-kit)，這些受體均以細胞膜顯現顯著黃色或顆粒狀被視為陽性著色，應用Shimizu提出的方法進行半定量分析。

1.3 統計學分析應用SPSS13.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，相關性應用Spearman等級進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同亞型腎癌組織中CD34與CD31標記的MVD值比較腎透明細胞癌與腎乳頭狀癌和腎嫌色細胞癌比較，CD34與CD31標記的MVD值均明顯較高(P＜0.05)，腎透明細胞癌組織中，CD34與 CD31分別標記的 MVD值比較，CD34高于CD31，但差異無統計學意義(P＞0.05)，而腎嫌色細胞癌與腎乳頭狀癌組織比較，CD34標記的MVD值顯著高于CD31標記的MVD值(P ＜0.05)。見表1。

表1 不同亞型腎癌組織中CD34與CD31標記的MVD值比較±s

表1 不同亞型腎癌組織中CD34與CD31標記的MVD值比較±s

注：與腎透明細胞癌比較，*P＜0.05

腎嫌色細胞癌(n=29) 48±14* 31±16* 3.270 ＜0.05腎透明細胞癌(n=66)126±47 99±55 0.091 ＞0.05

2.2 不同亞型腎癌臨床病理學與CD34、CD31標記MVD值的關系 CD34、CD31所標記MVD值與腎透明細胞癌組織學分級均呈負相關性，其中CD34標記MVD值(r=-0.597，P=0.003)，CD31 標記 MVD 值(r=-0.401，P=0.010)，且CD34標記MVD值的相關性較高(P ＜0.05)。CD34、CD31標記的MVD值與腎透明細胞癌的臨床分期階段也均呈現負相關性，其中CD34標記MVD值(r=-0.267，P=0.023)，CD31標記MVD值(r=-0.251，P=0.041)，且CD34相關性較高(P＜0.05)。而在腎乳頭狀癌與腎嫌色細胞癌組織中，CD34與CD31標記的MVD值與其組織學分級、臨床分期均無相關性。

2.3 不同亞型腎癌間的表達中RTK與其相關性分析 在腎乳頭狀癌組織的表達中，RTK受體中的VEGFR-1及VEGFR-3與其呈現明顯正相關性(r=0.304，P=0.001);VEGFR-2及VEGFR-3與其呈現明顯正相關(r=0.458，P=0.001)，而VEGFR-l與VEGFR-2未發現與其有相關性(P＞0.05)，PDGFR-α及PDGFR-β均未發現與其有相關性(P ＞0.05)，在腎嫌色細胞癌與腎透明細胞癌組織中，各個指標之間均未發現與其有相關性(P＞0.05)。見表2。

3 討論

腎癌的發展及預后與新生微血管有密切關系，因而研究MVD有重要意義，本文應用兩種內皮細胞標記物CD34與CD31對不同亞型腎癌組織的微血管進行標記，觀察其MVD值的變化，結果顯示，腎透明細胞癌與腎非透明細胞癌組織比較，CD34與CD31標記的MVD值均明顯較高(P＜0.05)，這與Baldewijns［6］的研究結果相似，這與腎透明細胞癌中的(VonHppel-Lindau，VHL)基因發生突變造成其蛋白功能發生變化有密切關聯，VHL蛋白出現變化［7，8］，血管新生與促進細胞增殖及血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)方面的相關基因被激活，而相關文獻報道稱，微血管密度MVD值與VEGF具有正相關性，這是造成其明顯升高主要因素。而從腎透明細胞癌病理組織學及臨床分期方面分析發現，CD34與CD31標記的MVD值均與其組織學分級呈負相關性，其腫瘤組織惡性程度越嚴重，MVD值相對越低，預后差，同時，CD34與CD31標記的MVD值與腫瘤臨床分期也呈現負相關性，臨床分期越高，預后越差，MVD值越低，本文結果與大多數研究結果相似。

同時通過CD34與CD31對不同亞型腎癌血管的標記染色處理，結果表明，于腎透明細胞癌組織中，二者標記的MVD值差異無統計學意義(P＞0.05)，但CD34略高于CD31，而在腎嫌色細胞癌與腎乳頭狀癌中，CD34與CD31所標記的MVD值比較，CD34顯著高于CD31，可見CD34反應更為敏感，能夠突出尚不成熟的微血管，其表達更加穩定，是檢測MVD值的最佳標記物。

此外，本文研究發現RTK受體與促進腫瘤血管新生有關，通過其在不同亞型腎癌表達間的相關系分析，得出結果顯示，在腎乳頭狀癌中，VEGFR-1及VEGFR-3與其呈現明顯正相關性，VEGFR-2及VEGFR-3與其呈現明顯正相關性，由此可見，這幾種受體間存在相互作用，相互誘導的因素，且表明了在VEGF因子異常時，腫瘤細胞發生了增殖活性升高的現象。

總之，隨著對CD34、CD31等內皮細胞標記物的研究，隨著分子生物技術的快速發展，對腫瘤微血管的研究也會隨之進步，為微血管密度與腫瘤轉移分型的關系的研究提供更加有利的條件，而對檢測RTK在不同亞型腎癌中的表達相關性，也將成為判斷腎癌，尤其是腎乳頭狀癌預后的重要指標，為臨床制定有效的個性化的治療方案提供更加有力的依據，有十分重要的意義和價值。

表2 腎乳頭狀癌組織中RTK表達之間的相關性分析

1 蔡大偉.血管生成素-2及其受體Tie2在腎癌中的表達及與微血管密度的關系.中華實用診斷與治療雜志，2010，24：214-215.

2 李旭東.膀胱尿路上皮癌血管內皮生長因子的表達與微血管密度相關性研究.中國基層醫藥，2011，18：3173-3174.

3 薛英明，孫培春，吳剛，等.CD133在胃癌組織中的表達及臨床意義.中華實用診斷與治療雜志，2011，25：122-124.

4 Shchors K，Evan G.Tumor angiogenesis：cause or consequence of cancer.Cancer Res，2007，67：7059-7061.

5 Thielemann A，Kopczyfiski Z，Filas V，etal.The determination of VEGF and MVD，among patients with primary breast cancer.Pathol Oncol Res，2008，14：137-144.

6 Baldewijns MM，Thijssen VL，Van den Eynden GG，etal.Higrade clear cellrenal cell carcinoma has a higher angiogenic activity than low-grade renal cellcarcinoma based on histomorphological quantification and qRTPCR mRNA expression profile.Br JCancer，2007，96：92-95.

7 侯秋雨，鄒金標.血管內皮生長因子和微血管密度在非小細胞肺癌組織中的表達和意義.河北醫藥，2011，33：3246-3247.

8 Delahunt B，Bethwalte PB，Nacey JN，etal.Outcome predictionfor renal cell carcinoma：evaluation of prognostic factors fortumours divided according to histological subtype.Pathology，2007，39：459-465.