4－羥基環(huán)孢菌素A衍生物[γHyMeLeu4］CyA生產(chǎn)菌的接合轉(zhuǎn)移

劉 靜，戴 夢，章 麗，趙 穎，鄭桂珍，張 佳，王富強

（華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊050015）

環(huán)孢菌素 A[1］（Cyclosporin A，CyA）作為高效免疫抑制劑廣泛應用于器官移植，不同生物活性的CyA衍生物，具有抗真菌、抗炎、抗寄生蟲、抗 HIV等功能[2］。

作者前期分離得到一株稀有放線菌CYA4OH，經(jīng)16SrDNA鑒定，屬于野野村菌（Nonomuraeasp.），該菌可以在CyA底物的4－位引入羥基，得到4－羥基CyA 衍生物[γHyMeLeu4］CyA。[γHyMeLeu4］CyA自身缺乏免疫抑制活性[3］，但具有潛在的抗真菌活性，還可以作為中間體進一步合成多種具有活性的藥物。

pZMW質(zhì)粒[4］含有PermE啟動子和病毒φC31的整合位點（attP），可以通過接合轉(zhuǎn)移將外源基因轉(zhuǎn)入到糖多孢紅霉菌染色體中。野野村菌與糖多孢紅霉菌同屬放線菌類，作者在此構(gòu)建了以硫鏈絲菌素抗性基因tsr為報告基因的表達載體pZMW－tsr，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli）ET12567（pUZ8002），采用接合轉(zhuǎn)移法將tsr基因轉(zhuǎn)入 [γHyMeLeu4］CyA 生 產(chǎn) 菌CYA4OH，嘗試在CYA4OH菌中表達外源基因，為其轉(zhuǎn)化機制及基因工程改造研究提供參考。

1 實驗

1.1 菌種、質(zhì)粒與培養(yǎng)基

本研究所用菌種均為自行保存。CYA4OH為[γHyMeLeu4］CyA生產(chǎn)菌，大腸桿菌DH5α為常規(guī)克隆和分子操作的宿主菌，大腸桿菌ET12567（pUZ8002）為接合轉(zhuǎn)移供體菌。

克隆載體pGEM－T購自Promega公司；表達載體pZM[5］、pZMW[4］為張部昌博士惠贈。

MS培養(yǎng)基：甘露醇2%，黃豆餅粉2%，瓊脂1.5%。

ISP2斜面培養(yǎng)基：酵母提取物0.4%，麥芽提取物1%，葡萄糖0.4%，瓊脂1.5%，pH 值7.3。

種子培養(yǎng)基：淀粉1.0%，葡萄糖0.7%，麥芽粉0.5%，酵母提取物0.45%，蛋白胨0.5%，碳酸鈣0.005%，pH 值7.0。

2×YT培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.6%，酵母抽提物1%，NaCl 0.5%，pH 值7.0。

1.2 主要試劑與儀器

PCR試劑、DNA Marker、膠回收試劑盒、連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver 2.0，Takara公司；……