養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠肝臟線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶的影響

楊曉暉 梁金環(huán) 尹 瑋

滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州 061001

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是嚴重威脅人類健康的常見內(nèi)分泌代謝疾病，肝臟作為長期受高血糖刺激的臟器之一，肝臟與糖尿病的關(guān)系逐漸受到人們重視。糖尿病肝病是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，其病因及發(fā)病機制仍未完全明了。糖尿病屬祖國醫(yī)學(xué)消渴證，陰虛為本[1]。養(yǎng)陰活血方藥是經(jīng)多年研究和臨床試驗的核心方劑[2]。琥珀酸脫氫酶（SDH）是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為線粒體需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，是反映線粒體功能的標志酶之一[3]。三磷酸腺苷酶（ATP酶）是維持胞內(nèi)離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和神經(jīng)元興奮性、沖動傳導(dǎo)、突觸傳遞的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，為葡萄糖和氨基酸的攝取提供驅(qū)動力，維持細胞生命活動，也是反映線粒體功能的重要酶之一[3-4]。本研究在線粒體水平研究糖尿病大鼠肝臟的損傷作用，并且觀察糖尿病大鼠肝臟線粒體中ATP酶和SDH活性的變化。同時采用養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠進行治療，研究其對糖尿病肝病的防治作用，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級健康雄性SD大鼠，體重為250～300 g，24只，由河北省實驗動物中心提供（動物合格證編號：809091）。

1.2 中藥配方

養(yǎng)陰活血方藥組成：熟地20 g、牡丹皮20 g、山藥15 g、山茱萸10 g等。

1.3 主要儀器及試劑

血糖檢測儀（購于強生公司），3K-15型高速冷凍離心機（Sigma公司），7200型可見分光光度計（上海尤尼柯公司），鏈脲佐菌素（STZ，Sigma 公司），線粒體提取試劑盒（批號 20090809）、ATP 酶測定試劑盒（批號 20090710）、SDH測定試劑盒（批號20090710）均購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 4月齡健康雄性SD大鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為三組：正常對照組（8只）；糖尿病模型組（8 只）；中藥干預(yù)組（8 只）。

1.4.2 糖尿病動物模型制備及給藥 除正常對照組外，其他兩組腹腔注射STZ造糖尿病模型。各組正常飼料喂養(yǎng)，正常對照組和糖尿病模型組自由飲水，中藥干預(yù)組按人與動物間體表面積折算的等效劑量比值灌喂給藥。

1.4.3 取材 造模成功后10周，對各組大鼠進行稱重，股動脈放血，并取肝臟，部分進行固定，其余立即放入液氮，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 ATP酶和SDH活性的測定 取一小塊肝組織，稱重，用勻漿介質(zhì)制成10%組織勻漿，提取線粒體，然后測SDH活性、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.5 肝線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察 取肝組織切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，用4%戊二醛進行固定，磷酸緩沖液浸洗3次，每次10 min，然后用鋨酸（10 g/L）固定2 h，環(huán)氧樹脂包埋，切片，染色，然后在電鏡下進行觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝線粒體ATP酶和SDH活性測定結(jié)果

與正常對照組比較，糖尿病模型組的SDH活性明顯降低，Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯降低（P＜0.01）。見表1。與糖尿病模型組相比，中藥干預(yù)組SDH活性、Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均有顯著升高（P ＜ 0.01）。 見表2。

表1 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性（糖尿病模型組與正常對照組）（U/mgprot，±s）

表1 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性（糖尿病模型組與正常對照組）（U/mgprot，±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；SDH：琥珀酸脫氫酶；ATP酶：三磷酸腺苷酶

組別 只數(shù)SDH Na+-K+-ATP酶 Ca2+-Mg2+-ATP酶正常對照組糖尿病模型組88 3.91±0.43 2.31±0.27*2.39±0.28 0.57±0.18*2.18±0.09 0.95±0.19*

表2 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性（中藥干預(yù)組與糖尿病模型組）（U/mgprot，±s）

表2 大鼠肝線粒體琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶活性（中藥干預(yù)組與糖尿病模型組）（U/mgprot，±s）

注：與糖尿病模型組比較，*P＜0.01；SDH：琥珀酸脫氫酶；ATP酶：三磷酸腺苷酶

?組別 只數(shù)SDH Na+-K+-ATP酶 Ca2+-Mg2+-ATP酶糖尿病模型組中藥干預(yù)組88 2.31±0.27 3.39±0.29*0.57±0.18 1.70±0.22*0.95±0.19 1.75±0.09*

2.2 肝線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

通過觀察透射電鏡下（×15 000）肝組織，與正常對照組比較，糖尿病模型組可見肝細胞線粒體空泡化，線粒體嵴大部分融合、消失，線粒體膜部分融合、消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，脫顆粒現(xiàn)象明顯。中藥干預(yù)組肝細胞線粒體無空泡，但是線粒體嵴和膜不清晰。而正常對照組肝細胞線粒體完整，線粒體嵴清晰。見圖1。

3 討論

糖尿病是一種新陳代謝疾病，以慢性高血糖為特征，因胰島素分泌、胰島素活性異常所致；糖尿病患者經(jīng)常伴有高脂血癥，心血管病病死率高[6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，2011年全球有近三億六千四百萬人罹患糖尿病。2004年全世界有340萬人因高血糖致死[7]。

肝臟是能量代謝的重要器官，含有豐富的線粒體，而線粒體是真核細胞中重要的細胞器，是細胞有氧呼吸的基地和能量供應(yīng)的場所，細胞生命活動大約95%的能量來自線粒體[8]；線粒體的一個重要生物學(xué)功能是氧化代謝和鈣代謝，其正常運行依賴于結(jié)構(gòu)的完整性。線粒體的氧化磷酸化功能與鈣平衡狀態(tài)密切相關(guān)。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶對調(diào)節(jié)線粒體膜內(nèi)外的離子平衡至關(guān)重要，其活性依賴于膜流動性并受ATP水平的影響[9]。細胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性下降，必然會導(dǎo)致細胞內(nèi)Na+超載，進而引起線粒體中的Ca2+釋放和細胞內(nèi)Ca2+超載；Mg2+-ATP酶活性下降則導(dǎo)致細胞內(nèi)Mg2+減少，削弱Mg2+-ATP酶對Ca2+超載的生理拮抗作用，抑制蛋白質(zhì)和能量合成，降低多種酶的活性，增加細胞膜的通透性，造成了離子分布狀態(tài)失衡和水積聚，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致組織細胞損傷和死亡。高血糖和血脂成分的變化造成膜酶的糖化，致使Na+-K+-ATP酶活性降低[10]，也會致線粒體結(jié)構(gòu)破壞，組織細胞凋亡。

SDH是嵌在線粒體內(nèi)膜上的一種多聚體酶，具有雙重作用；一是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵性脫氫酶，二是氧化磷酸化以及把電子直接傳遞給輔酶Q10的呼吸鏈的重要組分。SDH氧化琥珀酸形成三羧酸循環(huán)組分之一的延胡索酸，其氧化輔酶Q10形成線粒體電子傳遞鏈里的泛醇[11]。SDH活性的變化可反映細胞能量代謝情況和三羧酸循環(huán)狀態(tài)[12]，該酶活性的升高表明線粒體經(jīng)由短呼吸鏈中ATP產(chǎn)生的增加以及三羧酸循環(huán)的加快[13]；SDH活性增強時，琥珀酸受體的表達下降；而SDH活性逐漸降低時，琥珀酸受體表達則隨之顯著升高[14]。SDH是檢測線粒體損傷程度的敏感指標[15]。

實驗結(jié)果表明，與正常對照組比較，糖尿病模型組的鈉鉀ATP酶與鈣鎂ATP酶活性明顯降低，SDH活性明顯降低，觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，模型組可見肝細胞線粒體空泡化，線粒體嵴大部分融合、消失，線粒體膜部分融合、消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，脫顆粒現(xiàn)象明顯。這說明糖尿病使肝臟中線粒體損傷程度嚴重，表明糖尿病對肝臟會造成功能性損傷。

經(jīng)過10周的飼養(yǎng)，模型組大鼠肝臟線粒體SDH及ATP酶活力均有大幅降低，說明長期糖尿病可引起肝臟線粒體功能衰減，有可能引起肝組織線粒體鈉-鉀泵、鈣-鎂泵及呼吸鏈功能障礙，從而引起糖尿病肝病。有資料顯示，中藥可以治療糖尿病并發(fā)癥[16]。研究結(jié)果表明，與糖尿病模型組相比，中藥干預(yù)組SDH活性、鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶活性均有顯著升高，觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，肝細胞線粒體無空泡，損傷程度較輕，說明此配方中藥對糖尿病患者的肝臟線粒體損傷有明顯的防治作用。

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)中“消渴病”范疇，病因多為陰傷所致，本實驗所用養(yǎng)陰活血方藥由熟地、牡丹皮、山藥、山茱萸等中藥組成。其中熟地可滋陰補血，山萸肉可滋補肝腎，諸藥并用以奏養(yǎng)陰活血之功。研究結(jié)果表明，養(yǎng)陰活血方藥可有效提高SDH和ATP酶活性，這可能是養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠肝臟線粒體的保護作用機制之一。

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