異基因臍血干細胞穴位移植對類風濕關節炎大鼠細胞因子白介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白介素-4、白介素-10影響的實驗研究

姜兆榮 高明利▲ 于 靜 叢珊珊

1.遼寧中醫藥大學附屬醫院風濕病科，遼寧沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽 110032

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節滑膜及周圍結締組織異常增生、關節進行性破壞為特征的慢性自身免疫性疾病[1]。傳統的治療藥物，如免疫抑制劑、糖皮質激素、生物制劑等，雖能使部分患者的病情活動得以控制，但長期應用副作用較大[2]。間充質干細胞因具有免疫調節作用[3]，為RA治療帶來新的希望。本研究嘗試采用hUCBSCs穴位移植方法治療類風濕關節炎大鼠模型（CIA），觀察對白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）的影響，探討 hUCBSCs穴位移植治療RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

牛Ⅱ型膠原（C7809，5 mg，Sigma公司）；弗氏完全佐劑（098K8729-CAS9007-81-2，10 mL，Sigma公司）；流式細胞儀抗體PE-CD34。甲氨喋呤（MTX），上海醫藥集團有限公司信通制藥廠，產品批號002091。

1.1.2 實驗動物

近交系雌性Wistar大鼠120只，動物年齡45～50 d，體重（180±20）g，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.1.3 臍血

選擇遼寧中醫藥大學附屬醫院（以下簡稱“我院”）婦產科排除了 HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、梅毒等急、慢性感染，無血液系統疾患及其他系統疾病的非高危妊娠健康足月產婦，新生兒為經陰道順產且生后皮膚紅潤，四肢活動良好，無感染征象的臍血。本研究經我院倫理委員會通過，所有產婦及家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 臍血干細胞分離

將采集到的新鮮臍血用HES沉淀法分離臍血單個核細胞，制成MNC懸液，用臺盼藍拒染色試驗測細胞存活率，若細胞存活率＞95%，則進行下一步實驗。用MiniMACS磁性吸附性分離裝置，進行CD34+細胞的分離與純化，用臺盼藍拒染色試驗測細胞存活率，流式細胞儀測定CD34+細胞百分比[4]。將處理完畢的采集物低溫凍存以備回輸。

1.2.2 分組、造模與給藥

1.2.2.1 實驗分組 將近交系Wistar大鼠120只隨機分為六組：正常對照組（A 組）、模型組（B組）、hUCBSCs腕關節注射治療組（C組）、hUCBSCs尾靜脈注射治療組（D組）、hUCBSCs外關穴注射治療組（E組）、MTX灌胃治療組（F組），每組20只。

1.2.2.2 建立CIA動物模型 實驗模型采用鄧安梅法[5]。除A組外，寒冷刺激10 d后，將10 mg牛Ⅱ型膠原（BⅡC）與5 mL完全氟氏佐劑研磨后，以每只100 μL于大鼠背部、踝部、尾根部皮內注射免疫，免疫注射20 d后，于第21天按上述方法20 μL再次腹腔內注射，作為激發注射免疫。A組在寒冷刺激10 d后，按上述方法及相同部位注射等量的注射用水。

1.2.2.3 hUCBSCs輸注途徑及劑量 CIA大鼠免疫接種后第31天（除A組及B組用蒸餾水），開始hUCBSCs移植治療。C、D、E組分別向腕關節腔、尾靜脈、外關穴注射0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液和0.5 mL hUCBSCs懸液（含干細胞2×107/mL），F組MTX灌胃治療（MTX研成細末，加生理鹽水配成懸濁液灌胃0.0175 g/kg），每周1次。

1.2.2.4 指標檢測 在hUCBSCs輸注4周后ELISA法測定CIA 大鼠外周血細胞因子 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10的含量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 15.0統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗或方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A、B兩組大鼠血清中各指標比較

由于實驗操作等原因，在實驗過程中有3只死亡，其中B組死亡2只，F組死亡1只。B組大鼠血清細胞因子IL-1β、TNF-α明顯高于A組，而IL-4、IL-10明顯低于A組（P ＜ 0.05）。 見表1。

表1 A、B 兩組大鼠血清中各指標比較（μg/L，±s）

表1 A、B 兩組大鼠血清中各指標比較（μg/L，±s）

注：與 A 組比較，△P ＜ 0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10

組別 只數 IL-1βTNF-αIL-4 IL-10 A組B組20 18 0.362±0.027 0.658±0.034△1.864±0.132 2.953±0.186△7.862±0.531 5.876±0.512△50.342±6.100 42.415±3.014△

2.2 B組與各治療組各項指標的比較

與B組比較，各個治療組IL-1β、TNF-α明顯降低，IL-4、IL-10明顯升高（P＜ 0.05）。 與 F組比較，C、D組 IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10無明顯變化（P ＞ 0.05）。 與F 組比較，E組IL-1β、TNF-α 明顯降低，IL-4、IL-10明顯升高（P ＜ 0.05）。見表2。

表2 B組與各治療組各項指標的比較（μg/L，±s）

表2 B組與各治療組各項指標的比較（μg/L，±s）

注：與 B 組比較，*P ＜ 0.05；與 F組比較，#P ＜ 0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10

組別 只數 IL-1βTNF-αIL-4 IL-10 B組C組D組E組F組18 20 20 20 19 0.658±0.034 0.548±0.027*0.564±0.032*0.404±0.016*0.513±0.035*2.953±0.186 2.715±0.155*2.689±0.151*1.987±0.113*#2.704±0.149*5.876±0.512 6.763±0.512 6.773±0.526*7.584±0.548*#6.803±0.513*42.415±3.014 45.887±3.946*46.076±4.601*49.973±4.017*#46.143±3.478*

3 討論

造血干細胞移植是通過異體或自體的造血干細胞植入受者體內，使受者獲得造血和免疫功能重建的方法[6]。大量實驗及臨床資料已經證明臍帶血是極有潛力的造血干細胞來源[7-9]。臍帶血干細胞具有多向分化能力、免疫調節性能以及組織修復能力和低風險特性，并且其療效肯定，不需要組織配型，移植后沒有排斥反應。王秦等[10]在臨床上已經成功地應用異基因臍帶干細胞靜脈輸注的移植方法治療3例難治性RA，移植后能顯著改善病情，減少免疫抑制劑的用量。

穴位注射是在中醫理論的指導下，通過針刺與藥物注射相結合的一種注射方法[11-12]。針刺腧穴達到疏通經氣、調節臟腑氣血功能，同時又與藥物相結合發揮藥物治療作用，從而達到腧穴、針刺、藥物三者相結合的治療效果。藥物注入穴位后激發了腧穴的良性調整作用，具有吸收快和放大藥物治療作用的效應。這樣就可以減少藥物的用量，提高療效。外關穴為手少陽三焦經之絡穴，是八脈交會穴，通陽維脈[13]。外關穴注射異基因hUCBSCs治療RA，一方面具有針刺效應，調節陰陽，刺激神經-內分泌-免疫網絡，調節紊亂的免疫功能，另一方面發揮異基因hUCBSCs的作用，調節RA患者機體免疫紊亂，阻止病情進展。

本實驗研究hUCBSCs穴位移植治療CIA大鼠，在實驗中采用外關穴注射、腕關節腔注射及尾靜脈注射三種方法，結果顯示，三種治療方法對RA大鼠均有明顯的治療作用，外關穴位移植對RA大鼠細胞因子的影響更大，作用明顯優于MTX。這可能與穴位的作用不可分離[14-15]。異基因臍血干細胞外關穴位移植治療的特點就是調整機體的免疫功能，表現在能恢復和促進IL-4、IL-10含量使Th2升高，降低TNF-α、IL-1β的量使Th1降低，使失衡的Th1/Th2趨向平衡，可能是通過抑制炎癥細胞遷移、抑制內皮細胞黏附分子的表達、抑制滑膜細胞過度分泌細胞因子及炎癥介質[16-17]，從而減輕了臨床癥狀，延緩了病理進展，防止了關節畸變和功能破壞。

綜上所述，本項目是將傳統醫學的穴位療法與現代醫學的干細胞移植技術相結合，以期開辟一條新的移植途徑，可以使干細胞更為簡單、無創、準確地運送到目的地，探求對RA新的治療方法，并通過此進一步分析RA的發病機制。

[1]Aggarwal S，Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells mkdulate allogeneic immune cell responses[J].Blood，2005，105：1815-1822.

[2]王燕茹，張育.間充質干細胞與類風濕關節炎[J].實用醫學雜志，2011，27（16）：3068-3069.

[3]張穎，馬麗輝，李小峰，等.異基因骨髓間充質干細胞對類風濕關節炎患者主要細胞因子表達的影響[J].中國藥物與臨床雜志，2010，10：36-39.

[4]顧云，謝金萍，楊云.雪蓮注射液穴位注射治療類風濕性關節炎60例[J].山西中醫，2009，3（3）：30.

[5]梁昊.穴位注射鹿瓜多肽注射液配合中藥熏蒸治療類風濕性關節炎42 例臨床觀察[J].中醫中藥，2009，6（10）：104-105.

[6]Nauta AJ，Fibbe WE.Immunomodulatory propertics of mesenchymal stromal cells[J].Blood，2007，110：3499-3506.

[7]da-Silva Meirelles L，Chagastelles PC，Nardi NB.Mesenchymal stem cells reside in virtually all postnatal organs and tissues [J].J Cell Sci，2006，119：2204-2213.

[8]朱恒，江小霞，毛寧.破骨細胞參與調控骨髓造血微環境[J].中國實驗血液學志，2007，15：1312-1316.

[9]Li JN，Guo WT，Lin H，et al.Protective effects of brain-derived neurotrophic factor gene-modified human umbilical cord blood stem cells on spinal cord injury following transplantation [J].Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu，2007，11（20）：3972-3975.

[10]王秦，李小峰，馬麗輝，等.異基因臍帶間充質干細胞移植治療類風濕關節炎療效及安全性[J].中華臨床免疫和變態反應雜志，2011，5（3）：202-206.

[11]吳東海，王國春.實用臨床風濕病學[M].北京：中國醫藥科技出版社，2001：253-272.

[12]李小峰.重視類風濕關節炎發病機制及治療的研究進展[J].中華風濕病學雜志，2008，12：1-3.

[13]戴冽，湯美安.轉化生長因子β與類風濕關節炎[J].國外醫學：內科學分冊，1999，26：214-217.

[14]柏干蘋，方勇飛.細胞因子與類風濕性關節炎[J].臨床內科雜志，2001，18（4）：257-258.

[15]金譽，單根法，鐘竑.臍血干細胞的研究進展[J].上海第二醫科大學學報，2004，（5）：389-391.

[16]孟強，趙樹銘.提高臍血造血干細胞移植歸巢的研究進展[J].國際檢驗，2011，32（3）：366-368.