轉化生長因子-β1、腫瘤壞死因子-α、可溶性白細胞介素2受體及T細胞亞群與肺塵埃沉著病分期和肺功能的關系

劉超峰

鄭州煤炭工業集團有限責任公司總醫院呼吸內科，河南鄭州 452371

肺塵埃沉著病（簡稱塵肺）是在粉塵暴露場所長期工作的接塵工人常見的職業病，粉塵顆粒沉積引起肺成纖維細胞增殖和細胞外基質大量聚集導致肺間質彌漫性纖維化，隨著病情的進展疾病表現不僅局限于肺功能損害，而將導致全身免疫功能低下，誘發細菌感染、肺結核或獲得性人免疫功能缺陷綜合征等，而且治療難度大，目前尚無理想治療手段，是一種嚴重危害接塵工人生命的疾病[1－2]。轉化生長因子－β1（TGF－β1）在肺組織中對成纖維細胞有趨化作用，腫瘤壞死因子－α（TNF－α）作為一種炎性細胞因子也具有明顯的致纖維化性；而免疫系統可能在塵肺發生發展過程發揮重要作用，可溶性白細胞介素2受體（sIL－2R）具有抑制細胞免疫的作用，T細胞及其亞群則是細胞免疫主要免疫應答細胞。本研究觀察塵肺患者外周血及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF） 中 TGF－β1、TNF－α、sIL－2R 水平及外周血 T 細胞亞群，并分析其與塵肺分期及肺功能的關系，對各指標在塵肺發生發展過程中的作用進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

塵肺組：選擇2010年4月～2012年7月在鄭州煤炭工業集團有限責任公司總醫院治療的塵肺患者68例，均有明確的職業暴露史，并根據國家塵肺診斷標準（GBZ70－2009）經由職業病診斷機構確診，其中男59例，女9例，年齡 45～62 歲，平均（51.92±5.38）歲；塵肺分期：Ⅰ期 36 例，Ⅱ期19例，Ⅲ期13例；均為采煤工，接塵工齡9～32年，平均（16.37±5.92）年；接塵組：選擇無塵肺接塵工35例，男33例，女 3 例，年齡 43～61 歲，平均（50.24±6.46）歲，塵肺 0～0+，均為采煤工，平均（15.42±6.83）年。兩組均排除合并肺結核、局部或全身感染性疾病、慢性阻塞性肺疾病，免疫缺陷病或自身免疫性疾病，其他纖維化性疾病，惡性腫瘤，其他嚴重內科疾病，近期服用免疫調節劑的藥物史。對照組：選擇無塵肺非接塵體檢健康者，男30例，女5例，年齡45～65歲，平均（52.19±6.39）歲。三組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗室檢查 采集所有受試者清晨空腹外周血4 mL，2 mL離心后取上層血清，采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法檢測 TGF－β1、TNF－α、sIL－2R 濃度水平，2 mL 置于抗凝試管，采用美國Beckman Coulter流式細胞儀檢測CD4+、CD8+T細胞。采用滅菌生理鹽水進行灌洗，總量100～150 mL，回收率15%～30%，支氣管肺泡灌洗液（BALF）預處理后分別檢測 TGF－β1、TNF－α、sIL－2R 濃度水平，方法同上。TGF－β1、TNF－α、sIL－2R 單克隆抗體及熒光標記 CD4+、CD8+單克隆抗體和試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.2.2 肺功能檢查 采用美國森迪斯Vmax大型肺功能儀測定塵肺組患者肺功能，包括第1秒用力呼氣量（FEV1）、用力肺活量（FVC）、FEV1/FVC、25%用力呼氣容積（FEF25）、50%用力呼氣容積（FEF50）、75%用力呼氣容積（FEF75）、彌散功能（DLCO）。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗。等級資料相關性采用Spearman進行秩相關分析，兩變量相關性采用Pearson直線相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清TGF-β1、TNF-α、sIL-2R水平與塵肺分期的關系

塵肺組、接塵組和對照組血清TGF－β1和sIL－2R水平差異有統計學意義（F=5.672、8.219，P ＜ 0.05），塵肺組血清TGF－β1和sIL－2R水平顯著高于接塵組和對照組，對照組水平最低；塵肺組、接塵組和對照組血清TNF－α水平無顯著差異（F=1.275，P＞0.05）；且塵肺組不同分期血清 TGF－β1、TNF－α、sIL－2R 水平差異有統計學意義（F=5.297、4.273、6.829，P ＜ 0.05），不同塵肺分期血清 TGF－β1、sIL－2R水平均顯著高于接塵組和對照組（F=5.874、7.168，P ＜ 0.05），Ⅱ、Ⅲ期血清 TNF－α 水平顯著低于接塵組和對照組（P＜0.05）；采用Spearman秩相關分析，血清TGF－β1、sIL－2R 水平與塵肺分期呈正相關（r=0.69、0.78，P ＜ 0.05），血清 TGF－β1、sIL－2R 水平隨塵肺分期加重而升高，血清TNF－α水平與塵肺分期呈負相關（r=－0.39，P＜0.05），血清TNF－α水平歲塵肺分期加重而降低。見表1。

表1 不同組血清 TGF-β1、TNF-α、sIL-2R 水平比較（±s）

表1 不同組血清 TGF-β1、TNF-α、sIL-2R 水平比較（±s）

注：TGF－β1：轉化生長因子－β1；TNF－α：腫瘤壞死因子－α；sIL－2R：可溶性白細胞介素2受體

組別 例數 TGF－β1（ng/L） TNF－α（ng/L） sIL－2R（pmol/L）塵肺組Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期接塵組對照組68 36 19 13 35 35 131.54±23.18 97.28±21.84 137.54±39.57 146.87±31.74 68.64±12.64 52.67±10.27 51.34±13.45 53.48±10.57 46.67±12.94 38.95±8.97 51.73±11.68 50.97±10.64 154.92±24.16 119.57±20.57 156.82±23.92 187.63±34.68 97.54±11.28 82.46±8.97

2.2 BALF中TGF-β1、TNF-α、sIL-2R 水平與塵肺分期的關系

不同分期塵肺患者 BALF 中 TGF－β1、TNF－α、sIL－2R水平差異均有統計學意義（F=4.167、3.249、4.381，P ＜ 0.05），Ⅱ期塵肺患者BALF中TGF－β1水平最低，Ⅰ期塵肺患者BALF中TNF－α水平均高于Ⅱ、Ⅲ期，Ⅲ期塵肺患者BALF中sIL－2R水平均高于Ⅰ、Ⅱ期；采用Spearman秩相關分析，塵肺患者BALF中TGF－β1、TNF－α水平與分期無顯著相關（r=0.06、－0.14，P ＞ 0.05），塵肺患者 BALF 中 sIL－2R水平與分期呈正相關（r=0.41，P ＜ 0.05），BALF 中 sIL－2R水平隨塵肺分期加重而升高。見表2。

表2 不同分期塵肺患者BALF中TGF-β1、TNF-α、sIL-2R水平比較（±s）

表2 不同分期塵肺患者BALF中TGF-β1、TNF-α、sIL-2R水平比較（±s）

注：TGF－β1：轉化生長因子－β1；TNF－α：腫瘤壞死因子－α；sIL－2R：可溶性白細胞介素2受體

分期 例數 TGF－β1（ng/L） TNF－α（ng/L） sIL－2R（pmol/L）Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期36 19 13 1232.67±5.27 1015.97±8.16 1921.19±8.64 48.74±12.06 46.87±10.67 41.16±10.41 26.81±8.16 34.69±9.46 39.97±10.16

2.3 外周血T細胞亞群與塵肺分期的關系

塵肺組、接塵組和對照組外周血CD4+百分百差異無統計學意義（F=1.061，P ＞ 0.05），CD8+及 CD4+/CD8+差異有統計學意義（F=3.197、2.857，P ＜ 0.05），不同塵肺分期外周血CD4+、CD8+及 CD4+/CD8+差異有統計學意義（F=4.297、2.884、3.084，P ＜ 0.05），Ⅱ期塵肺外周血 CD4+、CD8+百分百最低，Ⅲ期塵肺CD4+/CD8+最低；Ⅱ、Ⅲ期塵肺外周血CD4+及CD4+/CD8+顯著低于接塵組和對照組（P＜0.05），Ⅰ、Ⅲ期塵肺外周血CD8+百分百顯著高于接塵組和對照組（F=3.429，P ＜ 0.05）；采用 Spearman 秩相關分析，外周血CD4+、CD8+百分百與塵肺分期無顯著相關（r= －0.11、0.14，P ＞ 0.05），而 CD4+/CD8+與塵肺分期呈負相關（r= －0.36，P＜ 0.05）。 見表3。

表3 不同組外周血T細胞亞群比較（%，±s）

表3 不同組外周血T細胞亞群比較（%，±s）

組別 例數 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+塵肺組Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期接塵組對照組68 36 19 13 35 35 41.67±6.94 42.21±7.19 31.68±6.92 35.19±7.82 43.67±6.83 42.97±5.69 37.91±6.28 38.16±8.92 33.97±6.29 39.72±7.29 31.92±5.97 33.19±9.08 1.05±0.24 1.09±0.19 0.97±0.16 0.89±0.18 1.39±0.27 1.28±0.22

2.4 外周血TGF-β1、TNF-α、sIL-2R水平及T細胞亞群與肺功能的關系

采用Pearson直線相關分析，外周血TGF－β1水平與FVC、FEV1/FVC 及 DLCO 呈負相關，sIL－2R 與 FVC、DLCO呈負相關，TNF－α水平與肺功能無顯著相關，CD4+百分百與FEV1/FVC、DLCO呈正相關，CD8+百分百與FVC呈負相關，CD4+/CD8+與FVC、DLCO呈正相關。見表4。

表4 外周血TGF-β1、TNF-α、sIL-2R及T細胞亞群水平與肺功能相關分析r值

2.5 外周血TGF-β1、TNF-α、sIL-2R水平與T細胞亞群的關系

外周血TGF－β1水平與CD8+呈正相關，與CD4+/CD8+呈負相關，TNF－α 與 CD4+/CD8+呈正相關，sIL－2R 與 CD4+、CD4+/CD8+呈負相關，與CD8+呈正相關。見表5。

表5 外周血TGF-β1、TNF-α、sIL-2R水平與T細胞亞群相關分析r值

3 討論

塵肺是一種職業病，患者預后差，勞動能力嚴重下降或完全喪失，生存質量低下，給患者家庭及社會都帶來沉重的負擔，近年來受到社會廣泛關注。肺間質纖維化是塵肺的主要組織病理學改變，發病機制尚未明確。粉塵是主要的致病原，患者多為從事產塵工作的人員，而細胞因子及免疫功能與塵肺發生發展有關[3-4]，本研究選擇的接塵組受試者，年齡、性別、職業、接塵時間等與塵肺組無顯著差異，而其癥狀及影像學檢查均未發現塵肺或未構成塵肺診斷，在一定程度上避免了人口學、環境因素的影響，重點就細胞因子及免疫功能在塵肺發展中的作用進行研究。

細胞外基質沉淀是肺間質纖維化的生物學基礎。TGF-β1被認為是目前發現的最強的細胞外基質沉淀促進因子，在肺間質纖維化過程中起關鍵作用。TGF-β1通過上調膠原和纖維粘連蛋白基因表達增加細胞外基質合成，同時抑制細胞外基質的降解，促進細胞外基質的沉淀；并且對成纖維細胞的聚集、增殖及轉化都有促進作用[5-6]。而其在塵肺發生和發展中的作用仍存在爭議，對TGF-β1基因多態性的研究認為，TGF-β（+915）GG基因型可能是塵肺的保護因素，TGF-β（509869800）位點基因多態性與塵肺易感性無關[7-9]；而李娟等[10]研究報道塵肺血清TGF-β1水平高于健康對照組，但隨著塵肺分期的增加反而降低。本研究結果顯示，塵肺組血清TGF-β1水平顯著高于接塵組和對照組，且隨著塵肺分期加重而升高，各期塵肺患者血清TGF-β1水平均高于接塵組和對照組，表明塵肺組患者血清TGF-β1高表達，且與塵肺分期密切相關。在BALF檢查中發現，檢出TGF-β1含量水平較血清明顯升高，提示TGF-β1在組織間液中濃度可能高于外周血液循環濃度，其發揮促纖維化作用可能主要在組織間，仍需進一步實驗研究證明。而BALF中TGF-β1水平與塵肺分期無關，可能由于灌洗液標本采集存在差異有關。血清TGF-β1水平與患者FVC、FEV1/FVC及DLCO呈負相關，表明TGF-β1的高表達與肺功能損害有關，促纖維化作用的增強，導致肺泡功能損害，與肺通氣及彌散功能關系尤為密切。

TNF-α是一種重要的炎癥因子，主要由Th1細胞分泌，具有強大的促炎癥反應和免疫損傷功能，在塵肺患者血清中高表達在導致肺間質組織損傷的同時發揮其促纖維化作用，通過與纖維連接蛋白作用是肺纖維化化初期病癥急性肺泡炎的發病機制之一，并且對細胞外基質沉淀有促進作用。有研究認為，TNF-α238位點基因多態性與塵肺易感性相關[11]。本研究結果顯示，塵肺組血清TNF-α水平均值與接塵組和對照組無顯著差異，但對著塵肺分期的加重血清TNF-α水平卻呈現降低的趨勢，與高彬等[12]Meta分析結果一致，血清TNF-α水平在塵肺初期表達升高，而隨著疾病進展逐漸降低，有觀點認為其可能在塵肺晚期表現為抗纖維化作用[13]，而筆者推測TNF-α在塵肺發病初期發揮誘導和促進的作用，其作用可能受到疾病進展的影響。這種影響可能來至于免疫系統功能障礙導致的細胞免疫功能抑制，TNF-α是Th1細胞因子，Th1細胞因子主司細胞免疫應答，因而TNF-α表達水平可能下調，本研究結果中血清和BALF中sIL-2R水平的顯著升高可以作為塵肺患者體內細胞免疫抑制的證明之一，sIL-2R是Th2細胞因子與細胞膜IL-2受體競爭結合IL-2，降低活化T細胞周圍的IL-2水平，減弱自分泌效應，抑制活化T細胞增殖，同時sIL-2R水平升高可減少膜IL-2受體密度，降低T細胞活化程度，從而抑制T細胞參與的免疫應答，是一種免疫抑制物，在多種腫瘤組織中高表達[14-15]。塵肺患者隨著病情進展，抵抗力低下可導致多種病原體感染疾病與免疫抑制狀態有關。本研究結果中，血清和BALF中sIL-2R水平顯著升高且隨塵肺分期加重而升高，表明塵肺患者可能存在免疫抑制狀態，且隨病情進展加重。外周血TNF-α與肺功能各指標均無顯著相關，而sIL-2R則與FVC、DLCO呈負相關，提示免疫抑制可能參與了肺通氣及彌散功能的損害。

T細胞亞群是免疫功能的主要應答細胞，主要分為CD4+和CD8+T細胞，CD4+T細胞通過分化為 Th1和Th2細胞，兩者存在動態平衡，當Th1/Th2向Th1漂移則趨向炎癥擴散，當向Th2漂移時則趨向纖維化，本研究結果中，TNF-α降低提示Th1/Th2可能向Th2漂移；CD8+T細胞則對免疫應答活化期有抑制作用，發揮免疫抑制。CD4+和CD8+T細胞也存在動態平衡，本研究結果顯示，隨著塵肺分期加重CD4+/CD8+T倒置，表明CD8+T細胞免疫抑制作用占據優勢，與sIL-2R水平升高結果相應，均表明塵肺患者存在免疫抑制，并且在疾病進展和肺功能損傷中發揮促進作用。結果顯示，外周血TGF-β1水平與CD8+呈正相關，與CD4+/CD8+呈負相關，TNF-α與 CD4+/CD8+呈正相關，sIL-2R與CD4+、CD4++/CD8+呈負相關，與CD8+呈正相關，提示TGF-β1的變化與機體免疫抑制存在密切相關，且與TNF-α、sIL-2R及T細胞亞群存在相互作用，共同參與塵肺的發生和發展。

本研究結果提示，不同分期塵肺患者均可能存在細胞免疫抑制狀態，外周血TGF-β1高表達可能參與了塵肺的纖維化過程和肺功能的損害，TNF-α與塵肺分期有關可能與肺功能損害無關，sIL-2R高表達及CD4+/CD8+倒置形成的免疫抑制參與塵肺分期進展和肺功能損害。

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