MicroRNA-196a抑制序列對人胰腺癌PANC1細胞株HOXB8基因表達的影響

劉明浩 杜奕奇 劉建強 高軍 吳洪玉 龔艷芳 李兆申

·論著·

MicroRNA-196a抑制序列對人胰腺癌PANC1細胞株HOXB8基因表達的影響

劉明浩 杜奕奇 劉建強 高軍 吳洪玉 龔艷芳 李兆申

目的觀察microRNA-196a(miR-196a)抑制序列轉染胰腺癌細胞株PANC1后對其HOXB8基因表達的影響。方法將PANC1細胞分為對照組、miR-196a抑制序列組和siRNA對照組。采用脂質體法將miR-196a抑制序列及對照siRNA分別轉染PANC1細胞。應用RT-PCR和蛋白質印跡法檢測轉染細胞miR-196a及其下游靶基因HOXB8 mRNA和蛋白的表達。結果轉染miR-196a抑制序列后，PANC1細胞miR-196a表達量較siRNA對照組顯著減少(0.050±0.054比0.839±0.025，t=3.12，P<0.05)；HOXB8 mRNA表達量較siRNA對照組增高1.57倍(2.20±0.07比1.29±0.10，t=3.86，P<0.05)；HOXB8蛋白表達量也顯著增強(0.90±0.03比0.40±0.10，t=3.11，P<0.05)。結論miR-196a可以下調HOXB8基因的表達。

胰腺腫瘤； 微小RNA； miR-196a； HOXB8

MicroRNAs(miRNAs)是長度為18～25堿基的內源性非編碼小分子RNA，其通過與靶mRNA3′端相結合導致mRNA降解或翻譯受抑制從而調節基因

的表達[1]。MicroRNA-196a(miR-196a)作為一種miRNA，可以在轉錄后水平調節細胞基因的表達[2]。目前研究發現，胰腺癌miR-196a高表達提示患者預后較差[3]。我們通過Targetscan miRNA靶基因預測軟件發現，HOXB8與miR-196a存在高度同源序列。而HOXB8基因能特異性地調節人體的發育，其過表達與結直腸癌相關[4]。為此，本研究應用miR-196a抑制序列轉染胰腺癌PANC1細胞，觀察轉染后細胞的HOXB8基因表達。

材料與方法

一、細胞培養及miR-196抑制序列轉染

PANC1胰腺癌細胞株購于中國科學院細胞庫，常規培養、傳代。接種細胞于25 cm2培養瓶，分為空白對照組、miR-196a抑制序列(antagomir，GeneCopoeia)組和siRNA對照組。待細胞生長至60%～70%融合時進行轉染。空白對照組培養液中只加lipofactamine 2000；miR-196a抑制序列組培養液中加lipofactamine 2000和miR-196a抑制序列(75 nmol/L)；siRNA對照組培養液中加lipofactamine 2000和與miR-196a不匹配的siRNA(75 nmol/L)。miR-196a抑制序列、不匹配的對照siRNA均購自Ambion公司，lipofactamine 2000轉染試劑盒購自Invitrogen公司，按照說明書操作，48 h后收集細胞。

二、實時定量PCR

采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取各組細胞總RNA。分光光度計法測定RNA純度和濃度。miR-196a反轉錄試劑盒及PCR試劑盒均購自Invitrogen公司。miR-196a序列為UAGGUAGUU-UCAUGUUGUUGGG(MIMAT 0000226)。在此基礎上設計針對miR-196a的具有莖-環結構序列：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG-CACTGGATACCCCAAC-3′。其上游及下游引物分別為GGGCTAGGTAGTTTCATGTTG及AGTGCGTGT-CGTGGAGTC。以U6作為內參，上游及下游引物分別為CTCGCTTCGGCAGCACA及AACGCTTCA-CGAATTTGCGT。先行逆轉錄反應，反應條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存待分析。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s，40個循環。利用Real-time PCR儀自帶軟件獲得Ct值，通過公式2-ΔΔCt計算Relative Quantification(RQ)值。實驗重復3次，取均值。

HOXB8引物上、下游序列分別為5′-CCATAA-AGCAATTCACAGATAGAGG-3′及5′-GGTTGCGAGGAAAGATG-3′，由上海英俊生物有限公司合成。應用SYBR Green法檢測HOXB8 mRNA，以GAPDH為內參，試劑盒購于Invitrogen公司。反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃或60℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環，最后72℃ 5 min。mRNA表達量計算方法同上，實驗重復3次，取均值。

三、蛋白質印跡法

提取細胞總蛋白，定量后常規行蛋白質印跡法檢測HOXB8蛋白表達。鼠抗人HOXB8一抗購自Abcam公司(Ab86610)，工作濃度1∶800；羊抗鼠IgG購自Abcam公司，工作濃度1∶1000；DAB顯色液購自Thermo公司。應用BIORAD Flour-S Muilti-Imager凝膠成像儀攝片，用ImageJ 1.42q分析軟件分析條帶灰度，以目的條帶與內參β-actin條帶灰度比值表示蛋白的表達水平。

四、統計學處理

結 果

一、各組細胞miR-196a的表達

空白對照組、siRNA對照組、miR-196a抑制序列組細胞的miR-196a表達量分別為0.840±0.025、0.839±0.025、0.050±0.054。miR-196a抑制序列組miR-196a表達較siRNA對照組顯著下降(t=3.12，P<0.05)，而兩對照組間的差異無統計學意義(P>0.05，圖1)。

二、各組細胞HOXB8 mRNA的表達

空白對照組、siRNA對照組、miR-196a抑制序列組細胞的HOXB8 mRNA表達量分別為1.00±0.05、1.29±0.10、2.20±0.07。miR-196a抑制序列組的HOXB8 mRNA表達量較空白對照組增高2.2倍(t=4.45，P<0．05)，較siRNA對照組增高1.57倍(t=3.86，P<0.05)，而兩對照組間的差異無統計學意義(P>0.05，圖1)。

圖1 miR-196a及HOXB8 mRNA的表達

三、各組細胞HOXB8蛋白的表達

空白對照組、siRNA對照組、miR-196a抑制序列組細胞的HOXB8蛋白表達量分別為0.30±0.06、0.40±0.10、0.90±0.03。miR-196a抑制序列組HOXB8蛋白表達較其他兩組均顯著增加(t=3.34，P<0.05；t=3.11，P<0.05)，而兩對照組間的差異無統計學意義(P>0.05，圖2)。

圖2 HOXB8蛋白的表達

討 論

目前研究已經證實miRNAs可能作為胰腺癌的癌基因或者抑癌基因參與其發生、發展[3]。Zhang等[5]檢測了10種胰腺癌細胞株及17例胰腺癌與配對癌旁正常胰腺組織的標本，有7種miRNA在胰腺癌細胞株及組織中表達顯著升高，包括miR-196a、miR-190、miR-186、miR-221、miR-222、miR-200b、miR-15b。Wang等[6]報道，胰腺導管腺癌患者血清miR-196a水平較正常人血清miR-196a水平顯著增高。Bloomston等[3]報道，高表達miR-196a的胰腺癌患者的預后較低表達患者差。Hoffman等[7]報道， miR-196a高表達人群的乳腺癌患病率較低，提示miR-196a在乳腺癌中作為一種抑癌基因。Schimanski等[8]研究證實miR-196a在結直腸癌中表達顯著升高，并且與結直腸癌細胞的遷移、侵襲及對化療藥物的敏感性有關，但與癌細胞的增殖及凋亡無關。Maru等[9]報道，Barrett′s食管患者miR-196a表達較正常人顯著增強，并且證實KRT5、SPRR2C和S100A9為miR-196a的靶基因。Qiu等[10]報道，miR-196a與非洲爪蟾的眼部發育有關，預示miR-196a可能作為治療眼部疾病的新的基因靶點。最近的研究[11]發現，miR-196a在黑色素瘤細胞表達較正常的黑色素細胞低，以上報道均說明miR-196a在腫瘤發生、發展中起著重要的作用。本實驗結果顯示，miR-196a在胰腺癌細胞株及組織中表達顯著增強，表明miR-196a參與胰腺癌的發生，起著癌基因的作用。

我們通過miRNA靶基因預測軟件發現HOXB8可能為miRNA下游靶基因。文獻報道HOXB8基因與哺乳動物胚胎發育相關，miR-196a可通過負調節HOXB8基因影響器官的發育[12]。最近報道HOXB8基因與結腸癌等腫瘤的發生、發展也存在一定相關性[13]。本研究將miR-196a抑制序列轉染PANC1細胞，結果顯示轉染后的PANC1細胞的HOXB8 mRNA和蛋白的表達增強，證實miR-196a是負調控HOXB8基因的，其調控機制需進一步探討。

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(本文編輯：屠振興)

EffectsofmicroRNA-196ainhibitorysequencesonHOXB8expressioninhumanpancreaticcancerPANC1cells

LIUMing-hao,DUYi-qi,LIUJian-qiang,GAOJun,WUHong-yu,GONGYan-fang,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the effects of microRNA-196a(miR-196a) inhibitory sequences transfection on HOXB8 expression in PANC1 cells.MethodsPANC1 cells were divided into control group, miR-196a inhibitory sequences group and siRNA control group. Liposomal transfection method was applied to transfect miR 196a inhibitory sequences and siRNA control into PANC1 cells. RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of miR-196a and HOXB8 mRNA and protein.ResultsAfter miR-196a inhibitory sequences transfection, when compared with that of siRNA control group, the expression of miR-196a was significantly decreased (0.05±0.054vs. 0.839±0.025,t=3.12,P<0.05); and the expression of HOXB8 mRNA was significantly increased by 1.57 folds (2.20±0.07vs. 1.29±0.10,t=3.86,P<0.05), the expression of HOXB8 protein was also obviously increased (0.90±0.03vs. 0.40±0.10,t=3.11,P<0.05).ConclusionsMicroRNA-196a down-regulates the expression of HOXB8.

Pancreatic neoplasms; MicroRNA; MicroRNA-196a; HOXB8

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.005

國家自然基金面上項目(30971344)；上海市科委基礎研究重點項目(11JC1416402)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申，Email:zhsli@81890.net

2011-07-18)