心肌梗死后大鼠periostin蛋白表達量與瑞舒伐他汀干預作用研究

張娟 崔天祥 李莉

心肌梗死后大鼠periostin蛋白表達量與瑞舒伐他汀干預作用研究

張娟 崔天祥 李莉

目的觀察心肌梗死后大鼠periostin(Pn)表達與瑞舒伐他汀的作用關系，探討瑞舒伐他汀在梗死后心肌重構中的作用機制。方法雌性54只遠交群(SD)大鼠，隨機分為正常對照組、模型組、瑞舒伐他汀組,每組18只。其中36只(SD)大鼠，結扎左前降支建立急性心肌梗死模型，隨機分為急性心肌梗死(AMI)對照組和瑞舒伐他汀(ROS)干預組；另18只為假手術組(Sham)，只穿線不結扎。ROS組大鼠以6 mgROS/(kg·d)灌胃，另兩組以等量清水灌胃。4周后測定各組大鼠膠原容積分數(CVF)、periostin蛋白及TGF-β1和periostin-mRNA表達量。結果與AMⅠ組相比，ROS組心肌CVF、periostin 蛋白及TGF-β1和periostin-mRNA表達量均顯著降低(P<0.05)，ROS組和AMⅠ組相關指標均顯著高于Sham組(P<0.05)。結論瑞舒伐他汀能夠顯著降低受損心肌中periostin表達水平，可能是其改善心肌重塑的機制之一。

瑞舒伐他??；心肌梗死；Periostin；大鼠

心肌梗死后心室重塑是個復雜的病理生理過程，是心力衰竭持續發展進程中極其重要的環節。在多種參與心室重塑的因素如神經體液因素、炎癥因子等的作用下，主要來源于心臟成纖維細胞的肌成纖維細胞(myofibroblast, MyoFBs)在以膠原沉積和間質纖維化為主要特征的基質重塑中，發揮了重要的調節作用。腎素-血管緊張素系統與肌成纖維細胞交互作用，對膠原代謝和間質纖維化起到重要的調控作用。因此，心肌梗死后肌成纖維細胞已經成為控制纖維化進展的重要靶細胞。對肌成纖維細胞的增殖及分化進行干預是治療心肌間質纖維化、防止心室重塑的可行途徑。

鑒于periostin的病理性促纖維化與血管新生作用，越來越多的研究者已經開始關注它在心血管疾病中的特殊功能。如何有效干預由其介導的細胞外基質沉積，對逆轉心肌梗死后心室重塑具有重要意義。本研究擬在利用瑞舒伐他汀調脂以外的作用，觀察其對急性心肌梗死后periostin的干預效果，探討其改善心肌重塑的機制，為利用瑞舒伐他汀改善急性心肌梗死后心肌重塑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要材料 瑞舒伐他汀片(阿斯利康制藥有限公司)；SP9000試劑盒(北京中杉生物工程公司)；DAB試劑盒(北京中杉生物工程公司)；RT-PCR 試劑盒(Transgene公司)；引物由北京博大泰克公司合成。periostin兔多克隆抗體(上海薩博生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立及分組 選取8周齡SD雌性大鼠，體重255～306 g，由鄭州大學實驗動物中心提供。隨機分3組每組各18只大鼠，假手術組：只在左前降支相應部位穿線。急性心肌梗死模型組：按文獻[1]的方法結扎左前降支建立。術后給予青霉素40萬U/(kg·d)預防感染，共3 d。術后24 h將急性心肌梗死大鼠隨即分為AMI對照組和ROS 干預組。ROS組每只老鼠以6 mgROS/(kg·d)溶于1 ml清水中灌胃，AMⅠ組和Sham組以1 ml清水灌胃。實驗大鼠均自由飲食。4周后頸椎脫臼法處死動物，摘取心臟，在梗死區沿左心室長軸一分為二，取梗死交界區組織，一部分10%甲醛固定后常規石蠟包埋切片，行病理鏡檢；一部分液氮保存，留做RT-PCR行periostin蛋白表達測定。

1.2.2Masson染色測定心肌膠原容積分數(CVF) 切片脫蠟，Masson染色法將膠原纖維染成綠色，心肌染為紅色，在光學顯微鏡下(×400)隨機選擇5個視野進觀察，使用圖像分析軟件(Biosens Digital Imaging System v1.6)分析，CVF的計算方法為：膠原面積/總面積。

1.2.3免疫組化檢測心梗交界區periostin的表達(SP法)免疫組化染色梗死交界區心肌組織，最后經DAB顯色、蘇木素復染后，陽染產物胞質呈棕黃色或棕褐色。各組圖片應用分析軟件(Biosens Digital Imaging System v1.6)進行圖像分析，隨機取5點測量，取平均值。陽性產物強度用圖像處理系統灰度值表示。

1.2.4RT-PCR檢測心梗交界區periostin mRNA的表達 用Trizol試劑處理梗死交界區心肌組織(約110 mg)提取總RNA。使用逆轉錄酶將8 μL總RNA合成cDNA。擴增Periostin序列上游引物：5’ ACTCCGTGTCTTCGTGTATC 3’，下游引物：5’ CTTTCTTCATTAGTCATTCCCT 3’，擴增片段為279bp；擴增TGF-β1序列上游引物：5’ CCCACTGATACGCCTGAG 3’，下游引物：5’ GGTTGTAGAGGGCAAGGAC 3’，擴增片段為469bp；內參GAPDH序列上游引物：5’ AAGTTCAACGGCACAGTCAA 3’，下游引物：5’ TCCACGACATACTCAGCACC 3’，擴增片段為128bp。取2 μl逆轉錄產物分別應用各組上下游引物進行 PCR擴增。擴增條件如下：94 ℃預變性2 min，1個循環；94 ℃變性30 s，退火30 s (periostin為52 ℃，TGF-β1為54 ℃，GAPDH為 55 ℃)，72 ℃延伸2 min，共35個循環； 72 ℃總延伸 5 min。取 5 μL PCR反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察電泳條帶，D-140圖像記錄分析系統進行分析，檢測因子mRNA的表達量及DNA條帶和GAPDH 的DNA條帶灰度值比值計算。

2 結果

2.1各組CVF及periostin蛋白表達量的比較 Masson染色顯示：Sham組有極少量膠原纖維形成，AMⅠ組大量膠原纖維形成，ROS組介于兩者之間；免疫組化染色結果顯示：AMⅠ組大鼠心肌細胞胞質中periostin表達量最多，ROS組相對減少；AMⅠ組及ROS組CVF、periostin蛋白均顯著高于Sham組(P<0.05)，ROS組CVF、periostin蛋白與AMⅠ組相比均顯著降低(P<0.05)，見圖1及表1。

圖1 各組大鼠心肌組織的免疫組化染色(SP染色法，×400)

注：A:Sham組；B: AMⅠ組；C: ROS組

2.2各組periostin mRNA表達的比較 AMⅠ組和ROS組與Sham組相比較，TGF-β1及periostin mRNA的表達均顯著增加(P<0.05)；ROS組與AMⅠ組相比，TGF-β1及periostin mRNA的表達均顯著減少(P<0.05)，見圖2及表2。

圖2 各組大鼠心肌組織periostin mRNA的表達(RT-PCR)

注：A:periostin mRNA的表達；B:TGF-β1 mRNA的表達。

M:DAN maker；1：假手術組；2：AMⅠ組；3：ROS組

表1 瑞舒伐他汀對CVF、periostin蛋白的影響

注：與假手術組比較，*P<0.05；與心肌梗死組比較，△P<0.05

表2 瑞舒伐他汀對periostin、TGF-β1 mRNA的影響

注：與假手術組比較，*P<0.05；與AMⅠ組比較，△P<0.05

3 討論

在心肌梗死發生直至壞死心肌被纖維組織替代這一過程中，肌成纖維細胞是梗死區域中主要的細胞類型，肌成纖維細胞通過增強的遷移、增殖及分泌活性增加膠原的產生，促進細胞外基質間的交聯，在促進損傷部位愈合和瘢痕組織形成的同時，引起膠原的過度沉積，纖維化的增加使心室的順應性下降，重塑明顯，導致心肌僵硬度增加和舒縮功能障礙,最終心力衰竭必然會出現。心肌梗死后腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活，Ang-Ⅱ可以刺激成纖維細胞等分泌轉化生長因子(TGF-β1)，引起膠原合成增多。體外實驗證實，TGF-β1誘導膠原分泌增加，使大鼠心臟成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達增高。

Periostin是一種細胞外基質蛋白，主要由成纖維細胞分泌，通過抑制心肌細胞擴散及成纖維細胞的黏附造成心肌肌束滑動進而導致心腔擴大和心功能受損[2]。損傷、壓力負荷、應激、炎癥等均可引起Periostin蛋白表達上調。periostin蛋白可與膠原-I、膠原-V、 粘連蛋白等基質蛋白結合參與生理性及病理性纖維化的形成[3]。Iekushi等[4]在急性心肌梗死大鼠中使用纈沙坦治療后發現，纈沙坦可通過抑制 periostin表達來改善心功能及心肌梗死后心室重塑。

許多研究表明，他汀類藥物除降脂外，還有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗增殖抗氧化應激、抗血檢形成、抑制新生血管形成等多重作用，目前被認為是治療冠心病及預防冠脈成形術后再狹窄的理想藥物。但他汀類藥物抑制VSMC增殖、遷移及血管再狹窄的機制仍未完全明了，他汀類藥物是否能通過抑制Pn表達而進一步抑制心室肌重構尚未見報道。然而他汀類藥物對AMI后心室重構的影響是否也與periostin表達有關，目前仍未見報道。

本研究以檢測心肌periostin的變化來反映瑞舒伐他汀的抗心肌重構作用。結果發現：與AMⅠ組相比，ROS組心肌periostin、TGF-β1表達明顯降低，膠原容積分數降低。實驗結果證實瑞舒伐他汀能夠降低梗死交界區心肌periostin的表達，可改善急性心肌梗死后心肌重塑，其機制可能為瑞舒伐他汀通過降低TGF-β1的水平，調節periostin的表達，從而減少膠原的沉積，這為治療急性心肌梗死后心室重構提供了實驗依據，但深入的其他機制尚待進一步探討。

[1] 王勇, 高大中, 殷躍輝, 等.大鼠心肌梗死模型建立方法選擇及心電圖表現.中國實驗動物學報,2011,19(6):525-529.

[2] KATSURAGI N, MORISHITA R, NAKAMURA N, et al.Periostin as a novel factor responsible for ventricular dilation. Circulation, 2004, 110(13):1806-1813.

[3] ZHOU HM, WANF J, ELLIOTT C, et al.Spatiotemporal expression of periostin during skin development and incisional wound healing: lessons for human fibrotic scar formation. J Cell Commun Signal, 2010, 4(2):99-107.

[4] IEKUSHI K, TANIYAMA Y, AZUMA J, et al.Novel mechanisms of valsartan on the treatment of acute myocardial infarction through inhibition of the antiadhesion molecule periostin. Hypertension, 2007,49 (6):1409-1414.

Effectsofrosuvastatinonexpressionofperiostinproteininratswithacutemyocardialinfarction.

ZHANGJuan,CUITian-xiang，LILi.

CardiovascularDepartment,TheSecondaffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou, 450014,China.

ObjectiveTo evaluate the effects of rosuvastatin on expression of periostin (Pn)protein in rats with acute myocardial infarction and to investigate the improvement of myocardial reconstruction mechanism.MethodsFemale adult SD rats were randomly divided into sham group, model group and benazepril group (18in each group). Thirty-six female SD rats with ligated LAD were used to establish models of acute myocardial infarction (AMI), twenty four hours later, the models were randomly divided into acute myocardial infarction (AMI) as control group and rosuvastatin intervention (ROS) group.Another 18 rats were tested with pierced but not ligated LAD as sham-operated group (Sham). Rats in ROS group were given rosuvastatin by gavage at 6 mg/(kg·d) dose levels to soluble in 1 ml clear water, whereas rats in the other two groups were given 1 ml clear water each day. Four weeks later, compare the differences of collagen volume fraction (CVF), periostin protein, TGF-β1 mRNA and periostin mRNA.ResultsMyocardial CVF, periostin protein, TGF-β1 mRNA and periostin mRNA were reduced in the ROS group compared with rats in the AMI group (P<0.05), both ROS group and AMI group were significantly higher than those in the Sham group (P<0.05).ConclusionRosuvastatin can reduce the expression of periostin in the damaged myocardial, may be one of the mechanism of myocardial remodeling improvement.

Rosuvastatin; Myocardiac infarction; Periostin; Rat

450014 鄭州大學第二附屬醫院心內科

張娟 E-mail：doczj@hotmail.com