參苓白術顆粒微生物限度檢查法的建立及檢驗結果分析

北京市藥品檢驗所（100035）王似錦 劉文杰 牛振東 江志杰 張光華 高春

參苓白術顆粒由參苓白術散發展而來，后者為經典方，出自《太平惠民和劑局方》，是在四君子湯的基礎上加山藥、蓮子、白扁豆、薏苡仁、砂仁、桔梗而成。功能主治為補脾胃，益肺氣。用于脾胃虛弱，食少便溏，氣短咳嗽，肢倦乏力[1]。2009年將參苓白術顆粒收載入《國家基本藥物目錄》。

中藥口服制劑由于其原料是中藥材和中藥飲片，大部分來源是植物根、莖、葉或全草，極易受到微生物的污染，如果生產和加工控制不利，則會導致成品的微生物污染問題，最終有可能會影響藥品質量，危害患者的健康[1]。因此，《中國藥典》2010年版一部[2]附錄制劑通則中規定，中藥顆粒劑應進行微生物限度檢查。本文對來自全國3個生產廠家54個批次的參苓白術顆粒進行微生物方法學驗證，建立了微生物限度檢查法，進行了微生物限度檢查，并對檢驗結果進行了分析討論。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DL-CJ-2ND型超級潔凈工作臺（北京東聯儀器制造有限公司）；HFsafe-1500生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司），生化培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.2 樣品 本試驗所用樣品來自3個生產廠家54個批次，詳細信息見附表2。

1.3 培養基和稀釋液 營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基（MUG）、乳糖膽鹽發酵培養基，均按照《中國藥典》2010年版一部附錄[2]要求配制，滅菌。稀釋液：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。按照《中國藥典》2010年版一部附錄[2]要求配制，滅菌。

1.4 菌種及菌液制備 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） [CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]均購自中國食品藥品檢定研究院。按照《中國藥典》2010年版一部附錄[2]要求配制菌液。

2 方法

2.1 供試液的制備 取本品10g，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖，制成1∶10的供試液。

2.2 細菌計數、霉菌和酵母菌計數驗證方法

2.2.1 菌液組 分別取“1.4”中的菌液1mL，注入平皿中，加入培養基，測定菌液中的菌落數，結果為a。

2.2.2 樣品對照組 取“2.1”中的1∶10的供試液1mL注入平皿中，加入培養基，測定樣品中的菌落數，結果為b。

2.2.3 驗證組 取“2.1”中的1∶10的供試液1mL和“1.4”中的菌液1mL分別注入同一平皿中，加入培養基，測定菌落數，結果為c。

2.2.4 稀釋劑對照組 取“2.1”中的稀釋劑1mL和“1.4”中的菌液1mL分別注入同一平皿中，加入培養基，測定菌落數，結果為d。

附表1 參苓白術顆粒微生物限度檢查驗證各菌的回收率（%）

附表2 參苓白術顆粒微生物限度檢查結果

據《中國藥典》2010版一部附錄[2]，若R2≥70%，而且R1≥70%，可認為該稀釋液制備方法和計數方法可用于該樣品的菌落計數。若R2＜70%則表明該稀釋液本身有抑菌作用，該稀釋液不可用于菌落計數。若R2≥70%，而且R1＜70%，可認為該稀釋液制備方法和計數方法不能用于該樣品的菌落計數。若使用藥典收載的稀釋液，稀釋劑對照組可不進行試驗。

2.4 微生物限度檢查 按照微生物方法學驗證所建立的微生物限度檢查法進行，并對結果進行分析討論。

3 結果

3.1 細菌計數方法學驗證結果 分別選取了3個生產廠家的各2批產品，按照2.2進行微生物方法學驗證，結果見附表1，采用常規注皿法，也就是1∶10的供試液，1mL/皿的方法進行驗證試驗，5種驗證菌株的回收率達到了70%以上，滿足藥典的要求。因此，細菌計數、霉菌和酵母菌計數應采用該方法進行。

3.2 霉菌和酵母菌計數、大腸埃希菌檢查和大腸菌群檢查方法學驗證結果 取1∶10的供試液10mL，置膽鹽乳糖培養基100mL中，陽性對照菌生長良好，此方法可行。

來自3個廠家的樣品，其中來自北京漢典制藥有限公司生產的參苓白術顆粒的生產工藝含有中藥原粉，因此需要進行大腸菌群檢查。其驗證結果為，取含10mL的乳糖膽鹽發酵培養基管3支，分別加入1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1mL，陽性對照菌生長良好，此方法可行。

3.3 微生物限度檢查結果分析 54個批次的參苓白術顆粒微生物限度檢驗結果見附表2。其中，霉菌和酵母菌數有1批的結果是15cfu/g，其余均為＜10cfu/g，大腸埃希菌檢查均為1g中未檢出，只有北京漢典的產品需要進行大腸菌群檢查，其結果均為＜10個/g。

對54個批次樣品的細菌數結果進行了統計，結果顯示，細菌數小于100cfu/g的檢品占總數的88.89%，大于100cfu/g小于1000cfu/g的占11.11%。沒有超過1000cfu/g的批次。54批次的參苓白術顆粒的微生物限度檢查結果統計為54個批次均符合規定，合格率為100%。

54個批次的參苓白術顆粒按照生產廠家進行分類，并分別按照細菌數x≤10，10＜x≤100，100＜x≤1000的批次數進行評價，結果見附表3。由云南騰沖生產的產品占總檢品數的44%，是抽取最多的一個生產廠家。與其他兩個企業相比，北京漢典生產的參苓白術顆粒細菌數小于10的只有1批，其余均大于10，這也許是由于企業所采用的工藝與其他兩家企業不同，其產品中含有中藥原粉，按照《中國藥典》的要求，應該進行大腸菌群檢查，并且細菌數的限值是10000cfu/g。

4 結論

對3個生產廠家的6批參苓白術顆粒進行微生物限度方法學驗證試驗表明，細菌計數、霉菌和酵母菌計數，采用1∶10的供試液1mL注皿。大腸埃希菌檢查和大腸菌群檢查均采用常規法即可。按照上述方法進行微生物限度檢查，結果表明，來自3個廠家54個批次的參苓白術顆粒的微生物限度均符合規定，結果較為滿意。

附表3 參苓白術顆粒細菌數分布表