高效液相色譜法同時測定強(qiáng)力定眩片中的天麻素、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷含量

北京市石景山區(qū)藥品檢驗所（100043）曾秋華

強(qiáng)力定眩片由天麻、杜仲、野菊花、杜仲葉、川芎制成，具有降壓、降脂、定眩的功能，其法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊》。原標(biāo)準(zhǔn)中檢驗項目僅有定性鑒別和常規(guī)檢查，缺乏反映藥品質(zhì)量的量化指標(biāo)，本文采用高效液相色譜法同時測定了強(qiáng)力定眩片中天麻素、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含量。該方法準(zhǔn)確、簡便、快速，可更好地控制強(qiáng)力定眩片的質(zhì)量。

1 材料

1.1 藥物及試劑 天麻素對照品（批號：110807-200205），綠原酸對照品（批號：110753-200413），松脂醇二葡萄糖苷對照品（批號：111537-200501）均購于中國藥品生物制品檢定所；強(qiáng)力定眩片（陜西漢王藥業(yè)有限公司）；自制空白樣品藥材購自北京同仁堂藥店；乙醇（分析純），乙腈（色譜純），磷酸（色譜純）；超純水為自制。

1.2 儀器 島津LCsolution-2010HTA型高效液相色譜儀：包括四元泵，紫外檢測器，柱溫箱，自動進(jìn)樣系統(tǒng)，CLASS-VP工作站。TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，BSA224S-CW及BP211D賽多利斯分析天平，KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，Milli-Q超純水機(jī)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ODSC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為A：0.05%磷酸，B：乙腈，梯度洗脫如下：0～6.0min，3%B；6～32min，3%～15%B；32～35min，15%～20%B；35～38min，20%～3%B；38～41min，3%B；檢測波長：天麻素、松脂醇二葡萄糖苷227nm；綠原酸327nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：28℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥12h的松脂醇二葡萄糖苷天麻素對照品、綠原酸對照品適量，用流動相溶解并定容制成含天麻素為104.1μg/mL、含綠原酸110.8μg/mL、含松脂醇二葡萄糖苷28μg/mL的對照品儲備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取約0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加稀乙醇25mL，稱定重量，45℃超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10mL，濃縮至近干，殘渣加流動相溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照品溶液制備 按照處方及生產(chǎn)工藝[1]，自制不含天麻、野菊花、杜仲、杜仲葉的空白制劑各一份，再按供試品溶液制備方法制備即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 陰性干擾試驗 在上述色譜條件下，精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10μL進(jìn)樣。色譜圖見附圖1～6，結(jié)果顯示天麻素峰、綠原酸峰、松脂醇二葡萄糖苷峰均與其他峰分離良好，陰性對照無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取天麻素、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷對照品儲備液1，3，5，10，15，20mL，分別置于20mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取系列對照品溶液續(xù)濾液10μL進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)、對照品進(jìn)樣量μg為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，見附表1。

附表1結(jié)果提示，天麻素、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷對照品在附表中的進(jìn)樣量范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與色譜峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗 精密量取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果顯示，天麻素、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的峰面積積分值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.35%、0.30%、0.70%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液，分別在0，4，8，12，16，20h注入液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果顯示，天麻素、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的峰面積積分值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）分別為1.17%、1.67%、1.90%，表明供試品溶液在20h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，按照2.2.2項下方法制備6份供試品溶液，在相同色譜條件下試驗。結(jié)果顯示，天麻素、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.03%、1.87%、1.04%，表明方法重現(xiàn)性良好。

附表1 3種成分的回歸方程(n＝6)

附表2 加樣回收率測定結(jié)果

附表3 3批樣品的三種成分含量測定結(jié)果(單位：mg/片)

2.3.6 加樣回收試驗 取同一個批次的樣品（批號：100103039），適量，研細(xì)，取細(xì)粉約0.25g6份，分別精密加入天麻素、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷對照品適量，按供試品溶液的制備項下制備，測定，求得天麻素、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷平均加樣回收率分別為97.81%、97.87%、95.03%，RSD分別為1.07%、2.02%、2.05%，結(jié)果見附表2。

2.3.7 樣品測定 分別取不同批號的強(qiáng)力定眩片3批，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見附表3。

3 討論

3.1 檢測波長的確定 參考《中國藥典》（2010年一版）[2]，取對照品溶液，用紫外分光光度計在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描，天麻素在220nm和270nm波長，綠原酸在220nm、246nm、327nm，松脂醇二葡萄糖苷在227nm和277nm有較強(qiáng)吸收，對各波長進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在227nm處三組分都具有較好的靈敏度，但綠原酸在327nm波長檢測時，吸收最強(qiáng)，峰型好，因此選擇227nm為天麻素、松脂醇二葡萄糖苷的檢測波長，327nm為綠原酸的檢測波長。

3.2 液相色譜條件考察 在參考有關(guān)文獻(xiàn)[3][4][5][6]的基礎(chǔ)上，對乙腈-0.05%磷酸（3∶97）、甲醇-水、甲醇-磷酸鹽溶液（0.1%磷酸二氫鉀與0.1%磷酸氫二鈉等量混合）-水等不同體系流動相進(jìn)行了比較，結(jié)果以乙腈-0.05%磷酸系統(tǒng)最佳，考察了多種不同的梯度洗脫條件，最后確定本實驗的色譜條件。

3.3 提取方法的選擇 在參考有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[7]，比較加熱回流提取1h和超聲提取30min的兩種方法，兩者檢驗結(jié)果無明顯差異，故選用操作簡單的超聲提取。

3.4 提取溶劑的選擇 比較甲醇、稀乙醇作為提取溶劑，甲醇和稀乙醇對指標(biāo)成分的提取效率相當(dāng)，從環(huán)保角度選用稀乙醇。