薄層色譜法鑒別雙黃連口服液中金銀花成分的改進

北京市朝陽區(qū)藥品檢驗所（100028）肖宏華 甄誠 劉開玉

雙黃連口服液具有疏風解表，清熱解毒的功效[1]，是常用中成藥。處方中金銀花成分是其清熱解毒、疏散風熱的關鍵成分。金銀花與山銀花來源不同，所含成分也有較大區(qū)別，使用中不能相互替代。《中國藥典》2010年版利用薄層色譜法僅對其所含金銀花成分中綠原酸進行鑒別。本研究在參考相關文獻[2][3][4][5][6][7]的基礎上，建立新的薄層色譜方法，增加對金銀花成分中所含木犀草苷進行鑒別，并利用山銀花中灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙特征成分[1]對其是否含有山銀花進行鑒別。優(yōu)選了樣品處理方法和薄層色譜展開條件，比較了不同的顯色劑，實驗結果表明該方法可鑒別出雙黃連口服液中木犀草苷成分以及是否使用了山銀花，方法簡便、專屬性強，為雙黃連口服液中金銀花成分的鑒別提供了依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

Linomat5半自動點樣儀、Digistore2數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士Camag）；LD5-2A型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇、甲酸、丙酮、95%乙醇、濃鹽酸、濃硫酸、三氯化鋁（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水（Limit RO-40-H系統(tǒng)制備）；高效硅膠G60薄層板（德國Merck）；金銀花對照藥材（121060-201107）、山銀花（灰氈毛忍冬）對照藥材（121595-201001）、木犀草苷對照品（11720-201106）、綠原酸對照品（110753-200413）、灰氈毛忍冬皂苷乙對照品（111814-201102）、川續(xù)斷皂苷乙對照品（111813-201202）均來源于中國食品藥品檢定研究院；4批雙黃連口服液為不同廠家生產(chǎn)的市售藥品（見附表）。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 取木犀草苷對照品，加70%乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液。另取綠原酸對照品、灰氈毛忍冬皂苷乙對照品、川續(xù)斷皂苷乙對照品，分別加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液。

2.2 對照藥材溶液的制備

2.2.1 取金銀花對照藥材1g，加甲醇10ml超聲處理20min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加水10ml使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次15ml，水液備用，取乙酸乙酯液蒸干，殘渣加70%乙醇2ml使溶解，作為金銀花對照藥材溶液①。

2.2.2 取2.2.1中備用水液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次15ml，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為金銀花對照藥材溶液②。

2.2.3 取山銀花（灰氈毛忍冬）對照藥材1g，按照2.2.1和2.2.2中方法制成山銀花對照藥材溶液①和山銀花對照藥材溶液②。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 取雙黃連口服液10ml，加濃鹽酸0.5ml，混勻，離心（3000rpm，10min），取上清液用氨試液調節(jié)pH值至6～7，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次15ml，水液備用，取乙酸乙酯液蒸干，殘渣加70%乙醇2ml使溶解，作為供試品溶液①。

2.3.2 取2.3.1中備用水液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次15ml，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液②。

2.4 陰性對照溶液的制備 取黃芩和連翹藥材按《中國藥典》2010年版一部雙黃連口服液項下的處方及制法，制成陰性樣品溶液。取10ml按上述2.3.1項下方法自“加濃鹽酸0.5ml”起制成陰性對照溶液①，按上述2.3.2項下方法制成陰性對照溶液②。

2.5 薄層色譜條件

2.5.1 木犀草苷、綠原酸 取木犀草苷對照品溶液、綠原酸對照品溶液、金銀花對照藥材溶液①、山銀花對照藥材溶液①、供試品溶液①、陰性對照溶液①各5μl，使用Linomat5半自動點樣儀，以條帶狀方式（條帶寬8mm）點樣于同一硅膠G60高效薄層板（用甲醇預展開，室溫下?lián)]干，在105℃活化30min）上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（7∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，揮干，紫外光燈（365nm）下檢視，并用Digistore2數(shù)碼成像系統(tǒng)采集數(shù)碼圖像。

附表 樣品信息

2.5.2 灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙 取灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙對照品溶液、山銀花對照藥材溶液①各5μl，再取金銀花對照藥材溶液②、供試品溶液②、陰性對照溶液②各10μl，使用Linomat5半自動點樣儀，以條帶狀方式（條帶寬8mm）點樣于同一硅膠G60高效薄層板（用甲醇預展開，室溫下?lián)]干，在105℃活化30min）上，以三氯甲烷-甲醇-水（6∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視并用Digistore2數(shù)碼成像系統(tǒng)采集數(shù)碼圖像。

3 結果

3.1 木犀草苷、綠原酸 按2.5.1條件展開得高效薄層色譜圖（略）。通過對圖譜中條斑的比較分析，金銀花對照藥材與4份供試品色譜中分別在Rf值0.56和Rf值0.63的位置上可檢出與綠原酸和木犀草苷對照品相對應的熒光條斑，但在木犀草苷位置的條斑顏色深淺不一，尤其在供試品2色譜中顏色很淺，反映出不同廠家之間其含量的多少有所區(qū)別。山銀花（灰氈毛忍冬）對照藥材在Rf值0.56和Rf值0.63的位置上也可檢出綠原酸和木犀草苷，但在相同提取條件下，山銀花（灰氈毛忍冬）中木犀草苷條斑的顏色明顯淺于金銀花。陰性對照色譜中相應位置均未檢出綠原酸和木犀草苷，表明陰性對照無干擾。該法可鑒別出供試品中除含有綠原酸外，還含有木犀草苷，不能區(qū)分使用的是金銀花還是山銀花（灰氈毛忍冬），但可區(qū)分是否為忍冬科植物的莖葉投料，莖葉中可檢出綠原酸，但不能檢出木犀草苷成分。

3.2 灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙 按2.5.2條件展開得高效薄層色譜圖（略）。通過對圖譜中條斑的比較分析，4份供試品色譜中分別在Rf值0.34與Rf值0.52的位置上均未檢出與灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙對照品顏色相對應的條斑。山銀花（灰氈毛忍冬）色譜中可檢出與上述兩種對照品一致的條斑，金銀花對照藥材及陰性對照色譜中相應位置均未檢出與上述兩種對照品相同的條斑，表明4批供試品中均未使用山銀花（灰氈毛忍冬），且陰性對照無干擾。該法可區(qū)分供試品中是否使用山銀花（灰氈毛忍冬），如有疑似條斑可進一步置紫外光燈（365nm）下檢視，上述二種對照品及山銀花主要條斑顯橙色熒光。

4 討論

4.1 該薄層色譜法可簡便、高效對雙黃連口服液中金銀花成分及是否使用山銀花（灰氈毛忍冬）進行鑒別，供試品中除應檢出綠原酸外，還應檢出木犀草苷，不應檢出灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷，如因對照品價格昂貴也可只用金銀花和山銀花對照藥材進行鑒別。本文中使用的山銀花為灰氈毛忍冬，另外的紅腺忍冬、華南忍冬、黃褐毛忍冬有待進一步研究。

4.2 供試品處理方法的比較：考察了①供試品適量濃縮至干，加甲醇適量溶解；②供試品用正丁醇萃取，濃縮；③供試品用乙酸乙酯和正丁醇分別振搖提取，濃縮。觀察上述3種提取方法所得的薄層色譜圖，前2種提取方法雜質較多，背景有干擾，相鄰條斑分離不清晰。第3種提取方法，所得薄層色譜圖效果最好，且加入適量濃鹽酸并離心可有效去除較多的雜質。

4.3 展開系統(tǒng)：比較了4個展開系統(tǒng)，A：三氯甲烷-甲醇-水（6∶4∶1）；B：乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（7∶3∶1∶1）；C：乙酸丁酯-甲酸-水（7∶4∶3）上層溶液；D：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）。C和D展開系統(tǒng)均不能將對照品、對照藥材及樣品很好地分離，A和B展開系統(tǒng)可分別用于兩類對照和樣品的展開，展開后條斑之間分離清晰，且信息量較豐富。

4.4 顯色劑的比較：木犀草苷為木犀草素-葡萄糖苷，用常用皂苷類顯色劑如10%硫酸乙醇溶液顯色，條斑顯色不清晰，日光下僅顯淡黃色；而直接在紫外光燈（365nm）下也僅顯示暗棕色斑點，效果不明顯；用1%三氯化鋁乙醇顯色后，在紫外光燈（365nm）下顯示清晰亮黃色斑點，相鄰條斑也可清楚識別，對綠原酸成分幾乎無影響。灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙選擇10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，顯色明顯，分辨清晰，而且可進一步在紫外光燈（365nm）下檢視。

4.5 不同廠家的供試品在與木犀草苷相對應位置上所顯的條斑顏色深淺不一，有必要建立高效液相色譜法進一步對其所含的木犀草苷含量進行研究。