水產品中3種氯霉素類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜測定法研究

梅光明 ，陳雪昌 ，張小軍 ，劉 琴 ，李佩佩 ，何依娜 ，郭遠明

（1.浙江海洋學院海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316100；2.浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316100）

氯霉素（Chloramphenicol，簡稱CAP）是一種有效的廣譜抗生素，曾廣泛應用于食用動物的疾病預防與防治。甲砜霉素（Thiamphenicol，簡稱TAP）和氟苯尼考(Forfenicol，簡稱FFN)為氯霉素的衍生物，抗菌譜和應用范圍與氯霉素也基本相同。臨床試驗表明食品中殘留的以上3種氯霉素類藥物能使人體產生再生性造血功能障礙以及致命的”灰嬰綜合癥”等毒副作用，其中以氯霉素毒性最強[1-3]。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的化學性質都極為穩定，在曾經用藥的食用性動物組織中很容易產生藥物殘留。為保障食品安全，目前各國對這3種氯霉素類藥物在食品中的殘留限量都做了嚴格規定。歐盟(EEC)96/23指令中將CAP列入禁用藥，并且規定氯霉素MRPL(minimum required performance limits)值為0.30 μg/kg，甲砜霉素MRL(maximum required limits)值為50 μg/kg,氟苯尼考的MRL值為100～2 000 μg/kg。目前水產品中的氯霉素類藥物檢測方法主要包括酶聯免疫法[4-5]、液相色譜法[6]、氣相色譜法[7-8]、氣質聯用法[9-10]和液質聯用法[11-13]。酶聯免疫法易產生假陽性結果，氣相色譜法和氣質聯用法需化學衍生化步驟，操作過程繁瑣復雜，因而液質聯用法成為氯霉素類藥物殘留量測定和結構確認的最佳方法。本試驗采用超高效液相色譜—串聯三重四級桿質譜儀測定水產品中的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，結合同位素內標法回收率高、定量定性準確可靠等特點，可以實現大批量樣品的氯霉素類藥物快速準確檢測。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity超高效液相色譜；Premier XE三重四級桿質譜儀（配電噴霧ESI離子源）；SL-502N型臺式天平；AL204型電子天平；IKA T18基本型組織搗碎機；德國IKA漩渦振蕩器；Eppendorf 5810臺式高速離心機；R-201型旋轉蒸發儀。

甲醇、無水乙酸銨、乙酸乙酯，均為色譜純。

乙酸銨溶液（5 mmol/L）：稱取0.385 g無水乙酸銨溶解于適量水中后定容至1 000 mL。

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標準儲備液：稱取適量純度大于98%的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標準品，分別用甲醇溶解并定容，配成100 μg/mL的標準儲備液，-18℃避光保存1年。

混合標準儲備溶液：分別準確吸取1.0 mL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標準儲備液，用甲醇稀釋并定容至100 mL，配成1.0 μg/mL的混合標準儲備液，-18℃避光保存6個月。

混合標準使用液：分別準確吸取10.0 mL和1.0 mL的混合標準儲備溶液，用甲醇稀釋并定容至100 mL，配成100 ng/mL和10 ng/mL的混合標準使用液，-18℃避光保存3個月。

內標標準儲備液：準確吸取100 μL的1.0 mg/mL氘代氯霉素（D5_CAP）標準溶液，用甲醇溶解并定容10 mL，配成1.0 μg/mL的內標標準儲備液，-18℃避光保存6個月。

內標標準使用液：準確吸取10.0 mL的內標標準儲備溶液，用甲醇稀釋并定容至100 mL，配成100 ng/mL，-18℃避光保存3個月。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：5 mmol/L 乙酸銨溶液（A）+甲醇(B)，梯度洗脫條件見表 1；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programme of mobile phase

1.2.2 三重四級桿質譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（ESI），負離子模式；毛細管電壓：3.50 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380 ℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；掃描模式：多反應監測（MRM），駐留時間：0.15 s。反應監測母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量Tab.2 Parent ions,daughter ions and collision energy of MRM

1.3 樣品前處理

稱取絞碎的魚糜樣品3.0 g于50 mL聚丙烯離心管內，加入100 μL內標標準使用液、15 mL乙酸乙酯和0.45 mL氫氧化銨后渦旋振蕩提取2 min，再加入5.0 g經450℃下烘干過的無水硫酸鈉，再次渦旋振蕩2 min，6 000 r/min離心5 min，上清液移入100 mL雞心瓶中。殘渣中再加入15 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩提取2 min，6 000 r/min離心5 min，上清液合并入雞心瓶中。45℃下旋轉濃縮至干，加入2 mL的5 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇(V/V，90+10)超聲5 min以充分溶解殘渣，加入5 mL正己烷渦旋混合30 s，40℃水浴中靜置5 min，6 000 r/min離心5 min分層后棄掉上清液，再加入5 mL正己烷重復操作1次，最后取1 mL樣液經0.22 μm有機相濾膜過濾后上機分析。

2 結果與分析

2.1 提取與凈化

氯霉素類藥物屬于弱極性物質，易溶于有機溶劑，可用甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等有機溶劑提取。通過比較甲醇、乙腈和乙酸乙酯3種溶劑提取效果，結果表明采用甲醇和乙腈作為提取溶劑的添加回收率較低，3種氯霉素類藥物的添加回收率均在60%以下，而采用乙酸乙酯作為提取溶劑時添加回收率可達到70%以上，這與文獻[14-15]報道的乙酸乙酯對氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的提取效率最高的結論一致。PFENNING等[16]發現提取液中加入少量的氨水對蝦等水產品具有更高的提取效率。本實驗采用堿化乙酸乙酯提取，濃縮后用正己烷脫脂兩次，可以有效去除水產品中的脂肪等雜質，上機分析結果表明MRM色譜圖基質干擾較小，回收率較高，滿足水產品中氯霉素類藥物分析檢測要求。

2.2 色譜條件選擇

本研究采用UPLC快速分離氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，每個樣品在3 min以內全部出峰，利用流動相梯度洗脫程序可以實現3個目標峰有較好的分離度。另外3種氯霉素類物質在電噴霧負離子模式下（ESI-）的離子響應強度比正離子模式下（ESI+）要高，通過在流動相中添加乙酸銨，可以進一步增加負離子模式下的離子響應強度，并改善峰型。

2.3 質譜條件選擇

在負離子模式下，用質譜蠕動泵在20 μL/min的流速下分別注入1.0 μg/mL的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氘代氯霉素標準溶液,在母離子掃描（MS Scan）模式下，m/z在 150～750掃描范圍內以進行一級質譜圖掃描,確定氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氘代氯霉素的分子離子，并比較不同錐孔電壓下的母離子強度，確定每個母離子有最大響應值時的最佳錐孔電壓值。在最佳錐孔電壓下，通過子離子掃描（Daughter Scan）模式下確定每種氯霉素類藥物的碎片離子，并選擇響應強度較高的2個子離子作為定量離子和定性離子，同時對碰撞電壓進行優化，確定碎片離子有最大響應強度時的最佳碰撞電壓值。優化后的參數見表2。在最佳質譜條件和色譜條件下，3種氯霉素類藥物混合標準品的UPLC-MS/MS色譜圖如圖1所示。

2.4 基質效應的消除

由于分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率，因而ESI離子源易受基質效應的影響，產生離子增強或離子抑制。當基質效應影響大時，會降低方法的靈敏度，影響方法的準確性。為最大限度消除基質效應干擾，本試驗采用基質匹配法進行定量分析。以空白魚糜樣品的提取液為標準溶液的稀釋溶液，可使標準溶液和樣品溶液具有相同的離子化環境，再結合采用氘代氯霉素作為內標物定量，從而較好地消除基質效應。空白草魚樣品添加標準溶液后測定圖譜如圖2所示。

圖1 2.00 ng/mL的CAP、TAP和FFN混合標準溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of CAP,TAP and FFN mxied standard solution(2.00 ng/mL)

2.5 線性范圍與檢出限

取適量3種混合標準使用液，用空白魚糜樣品提取液（提取時不加入內標物）稀釋配置成濃度分別為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 和 50.0 ng/mL的標準工作溶液，同時加入內標標準使用液，使內標物濃度均為5.00 ng/mL，進樣后以目標組分與內標物的峰面積比值Y對相應的質量濃度X(ng/mL)繪制標準曲線。通過添加標準品配制一定濃度的魚肉樣品，經前處理和檢測后，以S/N=10時為分析方法的定量檢出限。3種氯霉素類藥物的線性方程、相關系數和定量檢出限見表3。

2.6 準確度和精密度

以空白草魚和對蝦為測試對象，考察樣品3個梯度濃度加標下測定結果的準確度和精密度。實驗結果見表4，表4結果表明氯霉素在加標量0.10～2.00 μg/kg范圍內，平均回收率為84.7%～104.9%；甲砜霉素在加標量0.50～10.0 μg/kg范圍內，平均回收率為88.2%～104.1%；氟苯尼考在加標量0.50～10.0 μg/kg范圍內，平均回收率為91.9%～104.1%；且測定結果的批內相對標準偏差均小于15%，結果表明該方法準確度和精密度完全可以滿足水產品中氯霉素類藥物殘留檢測的要求。

圖2 草魚空白2.00 μg/kg CAP、TAP和FFN加標樣品測定MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of blank grass crap meat spiked with 2.00 μg/kg CAP,TAP and FFN

表3 3種氯霉素類藥物的測定線性方程、線性范圍、相關系數和定量檢出限Tab.3 Regression equations,linear range,correlation coefficients,and Quantitation limits of 3 chloramphenicol drugs

2.7 實際樣品測定

結合本單位承擔的農業部2012年流通環節鮑魚質量安全普查任務工作要求，課題組從北京、杭州和福州等城市的農貿市場、批發市場和超市采集了各品種鮑魚樣品共50份，對氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的殘留量進行檢測分析，結果中2個樣品檢出含有氟苯尼考，檢測值分別為14.3 μg/kg和2.01 μg/kg。

3 結論

本試驗建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中3種氯霉素類藥物殘留量，結合基質匹配標準曲線定量法和同位素內標法的優點，較好地消除了基質效應，方法前處理過程簡便快捷，檢測結果準確度高、精密度好，在大批量實際樣品的檢測中取得了滿意的結果。

表4 空白樣品中添加CAP、TAP和FFN的回收率和相對標準偏差（n=6）Tab.4 Recoveries and relative standard deviations of CAP,TAP and FFN in spiked samples(n=6)

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