浙江地區凡納濱對蝦苗3種對蝦病毒攜帶情況研究

施 慧，謝建軍，許文軍，余方平，郭 闖

（1.浙江海洋學院海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316100；2.江蘇省水產技術推廣站，江蘇南京 210036）

對蝦病毒病的流行和傳播成了養殖業發展的一大困擾，每年因蝦病造成的損失非常大對海洋資源的可持續發展造成巨大威脅，因此對蝦病毒病的研究已成為當前世界蝦病研究領域的熱點之一[1]。至今為止，全世界已經在養殖對蝦中發現20余種對蝦病毒病[1-4]，其中對蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、傳染性皮下組織壞死病毒（Infectious hypodermal&haematopoietic necrosis virus，IHHNV）和桃拉綜合癥病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）是當前嚴重危害我國對蝦養殖業發展的主要對蝦病毒[5]。

對蝦苗種是養殖生產的基礎，沒有優良的品種和健壯的苗種，就沒有高效的水產養殖生產，蝦苗的健康狀況和帶病與否是影響養殖成敗的關鍵之一。目前浙江省凡納濱對蝦、日本對蝦大部分苗種是通過外省調運經過當地苗廠暫養馴化，生產秩序混亂，對蝦苗種中病毒的攜帶及病毒的傳播給浙江省的對蝦養殖生產帶來了安全隱患。本研究通過對2009-2010年在舟山、寧波、三門等市縣凡納濱對蝦苗種養殖場調查取樣，采用OIE手冊[6]推薦的病毒檢測方法，對WSSV、IHHNV和TSV這三種我國報道的對蝦主要病毒進行普查，旨在了解浙江地區WSSV、IHHNV和TSV在種苗中的流行情況，分析凡納濱對蝦海水養殖中苗種病毒流行的主要特點，全面摸清對蝦海水養殖苗種生產情況，提出控制對策，為進一步提高水產苗種質量安全水平，加快水生動物疫病防治站建設，完善水生動物防疫體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2009-2010 年從鄞州、慈溪、象山、舟山、三門等地區22家對蝦苗種養殖場采集的凡納濱對蝦苗種樣品共118份，其中2009年28份，2010年90份。采樣參照OIE《水生動物疾病診斷手冊》[6]方法，樣品置95%乙醇中固定運至實驗室4℃，TSV檢測用樣品置RNA保護劑中，-70℃保存。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品總DNA的提取

取已固定蝦樣，攪動固定瓶中樣本，隨機取蝦樣碾碎，取上述勻漿樣本約50 mg懸浮于300 μL TE，使用DNA抽提試劑盒（Roche公司）制備檢測用DNA樣本，-20℃備用。

1.2.2 樣品總RNA的提取

取已固定蝦樣，攪動固定瓶中樣本，隨機取蝦樣碾碎，取上述勻漿樣本約50 mg，使用天凈沙柱式動物RNAout試劑盒制備檢測用RNA樣本，-70℃備用。

1.3 WSSV、IHHNV和TSV檢測引物的合成

WSSV采用KIMURA等[7]的nest-PCR引物，序列如下：

外引物：P1：5’ATCATGGCTGCTTCACAGAC 3’

P2：5’GGCTGGAGAGGACAAGACAT 3’

內引物：P3：5’TCTTCATCAGATGCTACTGC 3’

P4：5’TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT 3’

IHHNV采用OIE手冊（2009版）推薦的引物，序列如下：

389F：5’CGGAACACAACCCGACTTTA 3’

389R：5’GGCCAAGACCAAAATACGAA 3’

TSV采用OIE手冊（2009版）推薦的引物，序列如下:

9195：5 ’-TCA ATG AGA GCT TGG TCC-3’

9992：5 ’-AAG TAG ACA GCC GCG CTT-3’

1.4 WSSV的PCR擴增

PCR擴增儀為美國BioRad DNA Engine PCR儀。25 μL PCR反應體系，第一次PCR：引物為P1和P2，16.25 μL 滅菌雙蒸水，2 μL 10×Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L each），各 0.5 μL 5 μmol/L 引物，3 μL DNA模板，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，混勻后進行PCR反應。第二次PCR：除了引物換成P3和P4外，其它的與第一次PCR相同。

PCR反應條件：第一次反應條件：94℃變性4 min、94℃ 30 s、55℃ 45 s、72℃ 1 min，共39個循環，最后72℃延伸7 min，6℃保存。取5 μL PCR反應液在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察照相（該反應中特異性的擴增產物是982 bp）。第二次反應條件：94℃變性4 min、94℃ 30 s、50.8℃ 45 s、72℃45 s，共39個循環，最后72℃延伸7 min，6℃保存。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外檢測并拍照。（該反應中特異性的擴增產物是570 bp）每次檢測反應都設陽性對照（WSSV陽性DNA模板）和陰性對照（無模板和對蝦DNA樣本）。

1.5 IHHNV的PCR擴增

25 μL PCR 反應體系，包含 16.25 μL 滅菌雙蒸水，2 μL 10×Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L each），各0.5 μL 5 μmol/L 引物，3 μL DNA 模板，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶。PCR 反應條件：94 ℃變性 4 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，共35個循環，最后72℃延伸7 min，6℃保存。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外檢測并拍照。該反應中特異性的擴增產物是389 bp，每次檢測反應都設陽性對照（IHHNV陽性DNA模板）和陰性對照（無模板和對蝦DNA樣本）。

1.6 TSV的RT-PCR擴增

PCR 體系和反應參數如下：I.逆轉錄反應體系（10 μL）：2 μL 5×RT buffer，1 μL dNTPs （10 mmol/L each），0.5 μL Oligo-dT,0.5 μL RNase inhibitor（40 μ/μL）0.5 μL AMV Reverse TranscriptaseT，RNA 模板 2 μL，3.5 μL RNase free H2O。逆轉錄反應參數：42 °C 45 min，95 °C 5 min，冰浴5 min。II.PCR反應體系（25 μL）：18 μL 滅菌雙蒸水，2.5 μL 10×Buffer，0.5 μL Dntp（10 mmol/L each)，各 0.5 μL 5 μmol/L 引物，2.5 μL cDNA 模板，0.5 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶。PCR循環參數：94 ℃ 5 min，然后 94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s，共 35循環，最后60℃10 min。（該反應中特異性的擴增產物是213 bp）III。每次PCR檢測反應都設陽性對照（TSV陽性cDNA模板）和陰性對照（無模板）。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外檢測并拍照。

1.7 跟蹤監測

2010年采用PCR檢測方法對3個放養舟山某種苗場帶毒蝦苗的養殖戶蝦塘進行WSSV的跟蹤監測。

2 結果

2.1 苗種樣品中WSSV和IHHNV病毒檢測結果

從表1可以看出，采集的118份對蝦苗種樣品中，攜帶WSSV的有32份，占27.1%：攜帶IHHNV的有46份，占38.98%；同時攜帶WSSV和 IHHNV的有 20份，占16.95%，TSV均未見分離（圖1、圖2）。

圖1 對蝦苗種WSSV的套式PCR檢測結果Fig.1 Deteced the WSSV infection of postlarvae by nested PCR

表1 2009-2010年對蝦苗種樣品WSSV和IHHNV PCR檢測結果Tab.1 Detection of WSSV and IHHNV in Samples by PCR during 2009-2008

2.2 臨床跟蹤監測結果

2010年8月放養攜帶WSSV病毒苗種的3個對蝦養殖塘陸續發病，并出現大量死亡。病蝦殼內側呈現白色斑點，WSSV PCR檢測呈陽性（圖 3、圖 4）。

3 討論

本研究通過對鄞州、慈溪、象山、舟山、三門等市縣對蝦苗種養殖場調查取樣，采用OIE手冊推薦的病毒檢測方法，對WSSV、IHHNV和TSV這3種對蝦主要病毒進行調查，結果發現所采集的凡納濱對蝦苗種樣品中：27.1%的攜帶WSSV，38.98%的攜帶IHHNV，且同時攜帶此2種病毒的占16.95%，而TSV未見分離。說明浙江地區凡納濱對蝦苗種中有WSSV和IHHNV兩種病毒攜帶，且常存在混合侵染的情況。同時跟蹤監測結果顯示，放養攜帶WSSV蝦苗養殖塘的WSSV發病率明顯高于放養健康苗種的養殖塘，說明攜帶WSSV的蝦苗由于其抗逆性較差極易受外界環境影響而發病。

圖2 對蝦苗種IHHNV的PCR檢測結果Fig.2 Deteced the IHHNV infection of postlarvae by PCR

圖3 感染WSSV的凡納濱對蝦Fig.3 P.vannamei infected by WSSV

圖4 患病對蝦WSSV的PCR檢測結果Fig.4 Deteced the WSSV infection of diseased P.vannamei by P CR

對蝦白斑綜合征于1992年首次發現于中國臺灣，此后在世界范圍內傳播，每年給對蝦養殖業造成數百億元的經濟損失，成為威脅對蝦養殖業的主要疾病[8]。該病病原是WSSV，其主要的檢測方法有：目視觀察法、傳統組織學方法、電子顯微技術、生化檢驗法、細胞培養方法、免疫學的ELISA技術、分子生物學的核酸探針和PCR技術等[9-14]。PCR特異性高、簡單、快速，它不僅在病毒基礎生物學研究、病毒間比較研究中廣泛應用，而且在檢測對蝦是否攜帶病毒等方面也有較高的應用價值，已廣泛應用于WSSV檢測。一些學者還對PCR技術作了不同的改進，發展出套式PCR、競爭式PCR等方法[15-16]，使檢測方法更快速、準確。項目組應用套式PCR方法對采集的苗種樣本進行了檢測，但在次檢測過程中我們發現應用OIE手冊推薦的引物對（146F1/146R1、146F2/146R2）檢測苗種樣本時，59份樣只檢出1份WSSV陽性，但是應用Kimura的一組引物（P1/P2、P3/P4）檢出16份苗種樣本呈WSSV核酸陽性，說明該引物組更適于WSSV感染初期或潛伏期的蝦苗的檢測和環境監測。在本次檢測中還發現經一步PCR檢測為WSSV陰性的苗種樣品，套式PCR的檢測結果卻為陽性，說明套式PCR檢測法較普通的一步PCR有更高的靈敏度，適于WSSV感染初期或潛伏期的親蝦和蝦苗的檢測和環境監測。戰文斌等[17]研究發現海捕親蝦有WSSV感染的陽性個體，由其產的卵培育出的仔蝦也檢測有WSSV感染的陽性個體，因此存在病毒由親蝦傳播給蝦苗的感染途徑。目前雖然垂直傳播尚不明了但親蝦的糞便等排泄物污染了海水,通過海水進行水平傳播的可能性非常大，所以苗種養殖場的病毒檢測對苗種的質量安全十分必要。

對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病也稱慢性矮小殘缺綜合癥，該病是流行于美洲養殖對蝦的主要疾病之一，隨著我國對蝦種苗及親蝦的大量引進，我國部分對蝦養殖中已發現IHHNV，且呈流行趨勢。LIGHTNER等[18]研究發現，感染IHHNV或患病后存活下來的凡納濱對蝦會終生帶毒，并可通過垂直傳播把病毒傳給下一代和水平傳播傳給其他種群。本研究中對采集的118份苗種樣本進行IHHNV病毒PCR檢測，其中陽性比例占38.98%，且有20份樣本IHHNV和WSSV均呈陽性，這也說明了浙江地區的養殖對蝦苗種受IHHNV危害的嚴重性，提示有關部門應該加強防范，在蝦苗、親蝦的養殖、運輸和流通過程中采取有效措施，防止疫病傳入。

苗種是水產養殖生產的物質基礎，苗種的質量直接影響水產養殖的效益和成敗，也是影響養殖產品質量安全的重要因素。浙江省無對蝦親本繁育基地，所有苗種均需外調，然后培育至商品苗規格。調查共采集凡納濱對蝦苗樣品118份，其中80%樣本來自福建，10%來自海南，10%來自廣東。而國內苗種的親本大部分從國外引進。據不完全統計，2010年國內對蝦苗場總共從國外引進親蝦11萬對，且進口親蝦中80%以上都購于美國邁阿密SIS凡納濱對蝦育種基地。2010年，華南地區凡納濱對蝦養殖遭受近20年來最嚴重病害，發病率和排塘率都在50%以上，個別地區高達90%。國內專家經過一系列的調查研究認為今年的病害不是由已知病源引起，有可能是新病原，但發病原因與跟環境、苗種有很大關系。目前要控制對蝦病毒病的進一步發展，最有效的方法就是加強對蝦種苗的檢測工作，不允許把帶病毒的蝦苗流入到市場中去，同時要大力培育高健康蝦苗，從源頭上杜絕不良苗種的產生，這樣才是預防病毒病的根本所在。

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