核桃(Juglans regia L.)維生素E代謝相關基因jrVTE3 的克隆與分析

王燦燦，楊克強，孫 翠，郭先鋒，安海山，劉 霞

(1.山東農業大學林學院，山東泰安 271018; 2.山東農業大學作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018)

維生素E 是人體必需的脂溶性維生素，又稱為“生育酚”，在人體內通過抗氧化作用，增強機體免疫力，具有抗癌、預防心血管疾病和神經紊亂等功效［1－3］;在植物體內，維生素E 可清除體內的自由基，保護膜的完整性等作用［4－5］。利用基因組學和遺傳學原理，采用分子生物學技術，研究包括維生素E 在內的微營養素(Micronutrients)的合成、代謝和生物功能，提高作物產量，改善作物品質是當今作物育種的一個重要目標［6－7］。2－甲基－6－葉綠基－1，4－苯醌甲基轉移酶(MPBQMTase:2－methyl－6－phytyl－1，4－benzoquinol methyltransferase)屬于甲基轉移酶家族，在維生素E 合成代謝中催化2－甲基－6－植基－1，4－苯醌(MPBQ)向2，3－二甲基－5－植基－1，4－苯醌(DMPBQ)的合成，是γ－生育酚和α－生育酚生物合成過程中的關鍵酶。編碼該酶的基因VTE3 在藍藻聚球藻(Synechocystis sp PCC6803)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)中已被克隆［8－9］。將擬南芥VTE3和γ－生育酚甲基轉移酶(VTE4:γ－tocopherol methyltransferase)基因共同轉入大豆(Glycine max)，可使大豆種子中的α－生育酚含量增加約85%［10］。徐妙云等［11］將大豆Gm VTE3 基因在煙草(Nicotiana tabacum)中過量表達，雖然轉基因煙草種子中總生育酚水平與野生型煙草種子相比變化不大，但煙草種子中γ－生育酚與δ－生育酚的比值明顯增高，最高可達2 倍。核桃(Juglans regia L.)是我國重要的木本糧油戰略樹種，被認為是“21世紀的超級食品”，維生素E 是核桃營養構成的重要組分，總生育酚含量在5.57～34.74 mg/100 g 之間［12－15］。本研究利用RTPCR，通過RACE(rapid－amplification of cDNA ends)方法，克隆得到了核桃jrVTE3 基因，并對其序列特征進行了生物信息學分析，以期為研究核桃維生素E代謝，為核桃維生素E 含量和組分改良的分子設計育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料、載體、菌株及試劑

供試植物材料為9年生早實核桃‘香玲’開花后90 d 時的核桃胚組織。

The SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit、Reverse Transcription and cDNA Synthesis Kit 購自BD Bioscience Clontech 公司;Agarose Gel DNA Purification Kit、pMD18－T Kit、大腸桿菌DH5α 菌株、M－MLV 反轉錄酶、Taq 酶及Advantage Polymerase 購自TaKaRa 公司;DNA 膠回收Kit、小量質粒抽提Kit 購自上海生工;dNTP、引物由上海生工合成。其它試劑均為進口或國產分析純。cDNA 測序由博尚生物技術有限公司完成。

1.2 核桃jrVTE3 基因克隆的方法

1.2.1 RNA 提取和cDNA 第一鏈合成 采用改良CTAB 法［16］提取供試材料總RNA。cDNA 第一鏈的合成按Reverse Transcription and cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明操作。

1.2.2 jrVTE3 中間片段的克隆 根據植物MPBQ 基因的保守序列，設計擴增jrVTE3 基因中間片段的簡并引物:jrVTE3－F:GAG GGM GAY GCH GAG GAY CT;jrVTE3－R:CG VAC RCC DCK RTA CCA CTT。采用50μL 反應體系:1μL cDNA 模板(100 ng·μL－1)，1μL jrVTE3－F (10μmol·μL－1)，1μL jrVTE3－R(10μmol·μL－1)，5μL 10×Advantage Buffer (Mg2+plus)，1μL 50×dNTP mix (2.5 mmol·μL－1)，0.5μL Advantage Polymerase(5U)，40.5μL ddH2O。PCR 循環參數:95℃3 min，1cycle;94℃20 s，54℃20 s，72℃30 s，40 cycles;72℃5 min。

擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，按照Agarose Gel DNA Purification Kit 說明的操作步驟，回收目的片段。將目的片段連接到pMD18－T 載體，轉化DH5α 感受態細胞，將菌體均勻涂在含有X－gal/IPTG［20μL X－Gal(50 mg·mL－1)，10μL IPTG(240 mg·mL－1)］的Amp(100 mg·mL－1)抗生素平板上，37℃培養過夜。挑取陽性菌株接種于含Amp 的液體培養基中，37℃過夜，再進行單克隆菌液PCR 鑒定。PCR 體系為3μL 10×rTaq Buffer，0.5μL 50×dNTP mix (2.5 mmol·μL－1)，引物M13 F/R 各0.5μL(10μmol·μL－1)，0.25μL Advantage Polymerase(5U)，1μL 菌液，加ddH2O 至30μL。PCR 循環參數:95℃3 min;94℃20 s，57℃20 s，72℃30 s，35 cycles;72℃10 min。鑒定的菌株由博尚生物技術有限公司測序。

1.2.3 jrVTE3 的3＇－RACE和5＇－RACE 及全長克隆 根據jrVTE3 中間片段的擴增結果，分別設計3＇－RACE 及5＇－RACE 特異引物:GSPF:5＇ATGCCGAGGATCTTCCATTCCCAAC3＇;GSPR:5＇TTGGGAAGAGCATCCACATGTCAGC3＇。按照試劑盒說明制備3＇－RACE 及5＇－RACE－Ready cDNA。然后分別進行3＇－RACE和5＇－RACE 的PCR 擴增。PCR 反應體系為5μL 10×Adevantage Buffer(Mg2+plus)，1μL 50×dNTP mix (2.5 mmol·μL－1)，1μL 10×UPM (通用引物)(10μmol·μL－1)，1μL GSPF/R(10μmol·μL－1)，0.5μL Adevantage Polymerase(5U)，1μL 3＇－RACE－Ready cDNA/5－RACE－Ready cDNA(100 ng·μL－1)，加ddH2O 至50μL。PCR 循環參數為94℃30 s，72℃3 min，5 cycle;94℃30 s，70℃30 s，72℃3 min，5cycle;94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25 cycle。參照1.2.2 的方法分別回收3＇－RACE和5＇－RACE 的PCR 擴增產物，并克隆、鑒定、測序。

用DNAman(6.0)軟件拼接中間片段、3＇－RACE和5＇－RACE 的測序結果，根據拼接結果，設計jrVTE3基因全長克隆特異引物:MFL－F:5’ATCCTTCACGAAACTCTATCAG3’;MFL－R:5’TAGTTGATTGGCTGGGAAAG3’。參照1.2.2 的方法，PCR 擴增jrVTE3 基因全長。

1.2.4 jrVTE3 編碼的多肽序列分析 用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htmL)尋找jrVTE3 的開放閱讀框(open reading frame，ORF);用BioEdit(7.0.5.3)軟件對jrVTE3 基因編碼的多肽特點進行分析;用PBIL LYON－GERLAND 數據庫(http://npsa－pbil.ibcp.fr/cgi－bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)對多肽序列的進行二級結構預測。用SMART(http://smart.embl－heidelberg.de/smart)分析氨基酸序列的跨膜區域;在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜尋jrVTE3 保守域。

1.2.5 jrVTE3 的同源性分析利用 ClustalX(http://molecularevolution.org/software/alignment/clustal)軟件進行同源性序列的多重排定。用MEGA 5.0.3(http://www.megasoftware.net/mega.php)軟件基于Kimura 雙參數模型構建Neighbor－Joining 系統發育樹，經Bootstrap 1000 次循環檢驗系統樹的可靠性［17］。用DANman(6.0)軟件比較jrVTE3 基因編碼的氨基酸序列與其他植物的MPBQ 基因編碼的氨基酸序列的同源性。

2 結果與分析

2.1 jrVTE3 中間片段的擴增結果

采用改良CTAB 法從開花后90 d 核桃胚組織中提取總RNA，反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模版，用兼并引物jrVTE3－F/R 進行PCR 擴增，在近300 bp 處獲得與預期大小相符的條帶(圖1)。測序結果表明，該片段長度為302 bp(圖2)。在GenBank 中比較發現，該序列與其它植物已知的jrVTE3 基因同源性高達85%以上，表明擴增的片段為核桃jrVTE3 基因的中間片段。

2.2 jrVTE3 的RACE 擴增及全長克隆結果

在中間片段的內側，設計基因特異引物GSPF和GSPR。分別進行3＇－RACE 及5＇－RACE 擴增，3＇－RACE 擴增產物長918 bp，5＇－RACE 擴增產物長1027 bp(圖2 A，圖2B)。對3'端片段、5'端片段測序結果進行拼接，在5'－RACE 序列與3'－RACE 序列重疊區域內，部分片段與中間片段完全重疊，說明3'－RACE 及5'－RACE 擴增的結果是可信的。

用全長引物jrVTE3－F和jrVTE3－R 擴增cDNA 全長，獲得長約1300 bp 的片段(圖2C)。測序結果顯示，該片段序列長為1280 bp，在第687－958 堿基間有272 bp 的堿基序列和jrVTE3 中間片段序列完全重疊，說明這一序列為核桃jrVTE3 基因序列全長(圖2C，圖3)。

圖1 jrVTE3 基因中間片段的擴增Fig.1 The diagram shows intermediate fragments of jrVTE3 amplified by PCR M:Marker DL2000;泳道1:中間片段的擴增結果(目標片段如箭頭所示)

中間片段的測序結果為:

圖2 jrVTE3 基因的克隆Fig.2 Clone of jrVTE3

2.3 jrVTE3 編碼的多肽序列特點

在jrVTE3 序列在第181－1200 堿基處有長1020 bp 的開放閱讀框，編碼340 氨基酸(圖3)，其中強堿性氨基酸(K、R，H)有50個，強酸性氨基酸(D，E)有37個，疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V、P，M)有160個，不帶電荷的極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y，G)有91個。磷酸化位點分析表明，有10個絲氨酸(Ser)，1個蘇氨酸(Thr)和4個色氨酸(Tyr)位點，可能成為蛋白激酶磷酸化位點。jrVTE3 基因編碼的氨基酸疏水性最小值為－2.378，最大值達到2.556。多肽序列二級結構中延伸鏈(Extended strand)占45.00%，α–螺旋(Alpha helix)占39.41%，無規則卷曲(Random coil)占15.59%。

在多肽序列第121－130 氨基酸間有一個低成分復雜性(low compositional complexity，LCC)區域，在第307－329 氨基酸間有一個跨膜區段(Transmembrane segments，TS)(圖3)。在第117－214 氨基酸間包含一個S－甲基轉移酶(AdoMet－MTases)保守域(圖4)。

圖3 jrVTE3 序列全長和最大開放閱讀框架編碼的氨基酸序列Fig.3 Full length gene of jrVTE3 and amino acid sequence of the largest open reading frame

圖4 jrVTE3 多肽序列的保守域結構Fig.4 Conserved domains of amino acid sequences of jrVTE3

2.3 jrVTE3 序列的同源性分析

對jrVTE3 的cDNA 序列進行BLAST 同源性分析，挑選了11 條同源性較高的其他植物cDNA 序列，進行系統發育研究。結果發現，jrVTE3 基因與毛果楊(Populus trichocarpa)MPBQ/MSBQ 甲基轉移酶基因POPTRDRAFT_832825、蓖麻(Ricinus communis)葉綠體內膜包裝蛋白(chloroplast inner envelope protein)基因RCOM_0910770、葡萄(Vitis vinifera)37 kDa 內膜包裝蛋白基因LOC100266496、大豆(Glycine max)37 kDa 內膜包裝蛋白基因LOC100814346和LOC100788766 的同源性較高，可聚為一類(圖5 A)。其他如菠菜(Spinacia oleracea)葉綠體37 kDa 內膜包裝膜蛋白mRNA 序列X56963、葡萄37 kDa 內膜包裝蛋白基因LOC100240861、大豆37 kDa 內膜包裝蛋白基因LOC100806615、毛果楊MPBQ/MSBQ 甲基轉移酶基因POPTRDRAFT_643239、橡膠(Hevea brasiliensis)mpbqmt(2－methyl－6－phytylbenzoquinone methyltranferase)基因AB376092和mggbqmt(2－methyl－6－geranylgeranylbenzoquinone methyltranferase)基因AB376094 聚為一類(圖5 B)。

圖5 jrVTE3 基因與其它植物同源基因的進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of jrVTE3 and other homologue genes

對jrVTE3 編碼的氨基酸序列BLAST 比較，選擇橡膠AB376092(mpbqmt)基因編碼的蛋白序列BAH10641，葡萄LOC100240861 基因編碼的XP_002281313 蛋白序列及LOC100266496 基因編碼的XP_002283783 蛋白序列，萵苣(Lactuca sativa)MPBQ/MSBQ 轉移酶基因FJ376654 編碼的ACP43457 蛋白序列，毛果楊POPTRDRAFT_643239 基因編碼的XP_002300813 蛋白序列、POPTRDRAFT_832825 基因編碼的XP_002312559 蛋白序列、POPTRDRAFT_559613 基因編碼的蛋白XP_002307615 序列，蓖麻內膜包裝蛋白RCOM_0910770、RCOM_0990980 基因編碼的XP_002517053和XP_002520956 蛋白序列，共9 條蛋白質多肽序列。DANman 軟件對蛋白序列的同源性比較發現，這些多肽序列的一致性高達86.95%(圖7)。

圖6 jrVTE3 與選擇的其它植物的組蛋白同源性的比較Fig.6 Multiple sequence alignment of jrVTE3 with other plant homologue genes

3 討論

‘香玲’核桃堅果仁生育酚總含量在7.81～11.18 mg·100g－1，是重要的天然維生素E 源［12］。核桃胚在開花后90 d 處于營養合成代謝的旺盛時期，脂肪等營養物質的含量增加最快［18］。在油菜(Brassica napus)種子脂肪合成快速增加的時期，生育酚的生物合成也快速啟動［19］。因此本研究以‘香玲’核桃開花后90 d 的胚組織為材料，利用RACE 技術克隆了核桃2－甲基－6－葉綠基－1，4－苯醌甲基轉移酶基因。

jrVTE3 多肽序列中，除有一個低成分復雜性區域和一個跨膜區段外，還有一個第一類S－腺苷甲硫氨酸甲基轉移酶(AdoMet－MTases，Class I)的保守域(圖4，圖5)。AdoMet－MTases(Class I)以AdoMet(SAdenosyl－L－methionine)為底物，催化其上甲基向蛋白質、核酸、脂質等分子的N 或者O 原子等核受體(nucleophilic acceptor)轉移［20－21］。jrVTE3 編碼多肽序列的這些結構特點和其作為甲基轉移酶的功能是統一的。現已證實，除羥基苯丙酮酸雙加氧酶(p－hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD)外，所有與生育酚生物合成相關的酶類均定位于葉綠體內膜(inner chloroplast envelope)［22］。經KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)(http://www.genome.jp/kegg/)查詢，上述基因(或蛋白質)在功能上均參與泛醌(Ubiquinone)和其他萜類化合物(Terpenoid－quinone)的生物合成，主要的催化2－甲基－6－植基－1，4－苯醌(MPBQ)向2，3－二甲基－5－植基－1，4－苯醌(DMPBQ)的合成，和其他植物VTE3 基因的功能一致［8，23］

在已克隆的調控植物生育酚生物合成的5個基因中，經遺傳轉化表明，生育酚環化酶基因(VTE1:tocopherol cyclase)、尿黑酸葉綠基轉移酶基因(VTE2:homogentisic acid phytyltransferase)、VTE4、植醇激酶基因(VTE5:phytol kinase)在功能上均能提高生育酚總含量，改變生育酚組成成分［8，18，24］。VTE3 的表達及活性對植物生育酚總含量的影響不大，但可以改變植生育酚的組成［10，11］。在脅迫條件下，低溫對VTE3 的表達沒有變化，高鹽和無光條件條件均使VTE3 的表達顯著降低［25］。核桃jrVTE3 基因的克隆成功，對于進一步研究核桃堅果仁中維生素E 的合成的調控機制和核桃品質的遺傳改良具有重要意義，相關研究正在進行當中。

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