牛源性腸炎沙門氏菌的三型分泌系統基因分析

付紅蕾，李 彥*，杜冬冬，莊燕飛，常維山，王 濤

(1.青島市飼料獸藥檢測站，山東 青島 266071;2.山東農業大學，山東 泰安 271018;3.秦皇島出入境檢驗檢疫局，河北秦皇島 066000)

腸炎沙門氏菌是一類重要的革蘭氏陰性致病桿菌，可引起從輕度腹瀉到全身性感染等一系列不同程度的疾病。其中腸炎沙門氏菌能夠引起宿主發病與其三型分泌系統密切相關。三型分泌裝置將細菌毒力蛋白運送至宿主細胞中，改變宿主細胞的功能如信號傳導路徑、細胞骨架結構、膜轉運以及細胞因子的表達等。盡管轉運的效應蛋白因病原體的不同而不同，但是最近的研究顯示毒力相關的三型分泌裝置在沙門氏菌、志賀氏菌和耶爾森菌中結構很保守［1，2，3］。其中SipA 編碼分子量大小為87 kDa 的蛋白，與志賀氏菌IpaA 同源［4，5］。體外試驗顯示SipA和IpaA 都不是細菌侵襲細胞必需的蛋白［4，5，6］，但有研究顯示IpaA與細胞表面的紐帶蛋白作用后參與侵襲作用［7］。SipA 的突變使腸黏膜炎性反應程度下降和腹瀉程度減輕［9］。SipD 編碼分子量為38kDa 的蛋白，SipD 與SipB、SipC 不同，不侵入真核細胞［8］，是SipB、SipC和其它效應蛋白轉移必需的蛋白［10，11］。SipD 突變后細菌的侵襲能力下降［4，5］。SipA 基因、SipD 基因，發生突變將會影響細菌的致病性。本次試驗將該兩個基因為研究對象，研究該株牛源性腸炎沙門氏菌與其它沙門氏菌間致病性差異。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 由本實驗室從腹瀉犢牛中分離保存的一株腸炎沙門氏菌。

1.1.2 主要試劑 細菌基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生物技術公司);PCR 產物凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程公司);ExTaqDNA 聚合酶、dNTP、MgCl2、Trans2K PlusⅡDNA Marker 購自北京全式金生物科技有限公司;TGL－16B 型微量離心機(上海安亭科學儀器廠);JunYi JY200C 型電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)凝膠成像系統(美國UVP 公司，76－0312－02)。

1.2 方法

1.2.1 細菌DNA 提取及回收目的片段 嚴格按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書要求提取細菌全基因組。

1.2.2 PCR 擴增SipA 基因目的片段 PCR 擴增體系:10×buffer 2.5μL;Mg2+2μL;上游引物0.5μL;下游引物0.5μL;模板DNA 0.5μL;dNTP 0.5μL;雙蒸水18.3μL;ExTaq DNA 聚合酶0.2μL 。

擴增條件:94 ℃預變性10 min(94 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min 50 s，30個循環)72℃延伸10 min。

PCR 產物按照PCR 產物凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收，－20 ℃保存。

1.2.3 PCR 產物連接T 載體及轉化DH5(感受態細胞回收純化PCR 產物與克隆載體PEASY－T1 Cloning Vector 參照說明書進行連接，反應體系如下:

PCR 產物連接T 載體反應體系:PCR 產物0.5～4μL;PEASY－T1 Cloning Vector 1μL。

輕輕混合，室溫(20 ℃～37 ℃)反應5 min。反應結束后，將離心管置于冰上。采用CaCl2法轉化至DH5α 感受態細胞。

1.2.4 酶切鑒定 根據已發表的SipA 基因序列以及T 載體上的酶切位點，選用HindⅢ和EcoRⅤ雙酶切轉化成功的質粒，酶切體系如下:

酶切體系:質粒DNA 8.0μL;ddH2O 8.4μL;10×H Buffer 2μL;HindⅢ 0.8μL;EcoRⅤ0.8μL。

混勻后離心，37 ℃水浴酶切反應2 h，酶切產物于0.8% 瓊脂糖凝膠中150 V 電泳30 min，在凝膠系統下記錄結果。

1.2.5 SipD 基因PCR 擴增目的片段 PCR 擴增體系:10×Buffer 2.5μL;Mg2+2μL;上游引物0.5μL;下游引物0.5μL;模板DNA 0.5μL;dNTP 0.5μL;雙蒸水18.3μL;ExTaq DNA 聚合酶0.2μL。

擴增條件:94 ℃預變性10 min (94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min 50 s，30個循環)72 ℃延伸10 min。

PCR 產物按照PCR 產物凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收，－20 ℃保存。

1.2.6 PCR 產物連接轉化及酶切 連接及轉化體系同SipA 基因，根據已發表的SipD 基因序列以及T 載體上的酶切位點選用Apal和Notl 雙酶切，酶切體系如下:

酶切體系:質粒DNA 8.0μL;ddH2O 8.4μL;10×H Buffer 2μL;Apal 0.8μL;Notl 0.8μL。

混勻后離心，37 ℃水浴酶切反應2 h，酶切產物于0.8% 瓊脂糖凝膠中150 V 電泳30min，在凝膠系統下記錄結果。

1.2.7 SipA 基因、SipD 基因測序分析 將連接轉化成功的質粒送上海生工進行測序，測定好的SipA 基因、SipD 基因測序在GeneBank 上進行比對，以確定分離菌與其他菌株親緣關系。

2 結果

2.1 SipA PCR 膠回收及酶切結果

SipA 基因經PCR 擴增后取20μL PCR 產物在0.8% 瓊脂糖凝膠上電泳30 min，用凝膠回收試劑盒回收目的片段，回收目的片段在凝膠成像系統觀察。SipA 基因PCR 擴增到與預期目標2058 bp 大小一致的目的片段(圖1)，PCR 產物回收純化后，克隆至pEASY－T1 載體，構建重組質粒。重組質粒轉化到E.coli DH5α 感受態細胞中，提取質粒，進行HindⅢ和EcoRⅤ雙酶切鑒定。酶切得到兩條片段，分別為載體片段約3928 bp、目的片段約2058 bp(圖2)，表明目的基因已經插入pEASY－T1 載體。

圖1 SipA 基因PCR 擴增圖Fig.1 PCR amplification of SipA gene

圖2 SipA 基因酶切鑒定圖Fig.2 EcoRΙ/HindⅢdigests of plasmid profile

2.2 SipD 膠回收及酶切結果

SipD 基因經PCR 擴增后取20μL PCR 產物在0.8% 瓊脂糖凝膠上電泳30 min，用凝膠回收試劑盒回收目的片段，回收目的片段在凝膠成像系統觀察。SipA 基因PCR 擴增到與預期目標1032 bp 大小一致的目的片段(圖3)。PCR 產物回收純化后，克隆至pEASY－T1 載體，構建重組質粒。重組質粒轉化到E.coli DH5α 感受態細胞中，提取質粒，進行HindⅢ和EcoRⅤ雙酶切鑒定。酶切得到兩條片段，分別為載體片段約3928 bp、目的片段約1032 bp(圖4)，表明目的基因已經插入pEASY－T1 載體。

圖3 SipD 基因PCR 擴增圖Fig.3 PCR amplification of SipA gene

圖4 SipD 酶切鑒定圖Fig.4 Apal/Notl digests of plasmid profile

2.3 SipA 基因系統進化樹分析

本次分離株的SipA 基因系統進化樹分析結果表明，本次分離株與腸炎沙門氏菌P125109、都柏林沙門氏菌CT_02021853、新港沙門氏菌SL254 同源性高達100%。與鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌等其它幾株沙門氏菌的同源性相對較低(圖5)。

圖5 SipA 基因系統進化樹Fig.5 The phylogenetic trees of SipA gene

2.4 SipD 基因進化分析

本次分離株的SipD 基因系統進化樹分析結果表明，本次分離株與腸炎沙門氏菌P125109、都柏林沙門氏菌CT_02021853、新港沙門氏菌SL254、海德堡沙門氏菌B182、雞白痢沙門氏菌RKS5078 同源性高達100%。與鼠傷寒沙門氏菌等其它幾株沙門氏菌的同源性相對較低(圖6)。

圖6 SipD 基因系統進化樹Fig.6 The phylogenetic trees of SipD gene

3 討論

很多致病菌都擁有一個進化保守的三型分泌系統，這些致病菌通過三型分泌系統分泌一系列效應蛋白分子進入真核宿主體內，這些效應蛋白能夠調節宿主細胞的正常信號通路并且發揮致病作用。Ⅲ型分泌系統通常由30～40 kbp 大小的基因組編碼，以毒力島的形式存在于細菌的大質粒或染色體。本試驗研究了一株腸炎沙門氏菌毒力島的SipA 基因、SipD 基因的結構和遺傳變異。

研究發現，該株由腹瀉犢牛體內分離的腸炎沙門氏菌與腸炎沙門氏菌P125109 同源性達100%，該株細菌最早在蛋雞體內分離到。腸炎沙門氏菌P125109 臨床上能夠引起蛋雞腹瀉，與本次臨床分離株腸炎沙門氏菌能夠引起犢牛腹瀉相似。通過SipA 基因、SipD 基因進化樹分析發現，與臨床分離株SipA 基因、SipD 基因同源性均為100%的菌株有腸炎沙門氏P125109、都柏林沙門氏CT_02021853、新港沙門氏菌SL254。研究發現腸炎沙門氏菌P125109、都柏林沙門氏菌CT_02021853、新港沙門氏菌SL254，在致病性上與臨床分離株腸炎沙門氏菌保持高度相似。

本研究應用PCR 方法對分離株腸炎沙門氏菌成功克隆出SipA 基因、SipD 基因，通過與GenBank 提交的序列比對發現，該基因在腸炎沙門氏菌中穩定遺傳，但是在不同型的沙門氏菌中有變異。

4 結論

4.1 本研究表明，引起犢牛腹瀉的腸炎沙門氏菌含有毒力島SipA 基因、SipD 基因;

4.2 腸炎沙門氏菌毒力島SipA 基因、SipD 基因高度保守，可用作沙門氏菌的分型和分子診斷目標基因。

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