抑菌微生態制劑替代飼用抗生素技術研究

丁文秀，李 震，李敬忠，徐玉新*

(1.山東農業大學 資源與環境學院，山東 泰安 271008;2.山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000;3.泰安市泰山區環境保護局，山東 泰安 271000)

1 前言

20世紀40年代來，抗生素作為飼料添加劑及獸藥來預防治療疾病和促進生長［1］。然而，大量使用抗生素使動物產生耐藥性［2］，動物體內殘留的抗生素通過食物進入人體［3］，病原菌的抗藥性對人體健康存在威脅［4］。日本和美國等對飼料中添加抗生素做出嚴格的限制［5］。

具有防病、促生長的飼料添加劑除抗生素外，還有微生態制劑［6］。微生態制劑是根據微生態理論，從動物體內外分離的對動物有益微生物，經特殊加工制成含有益微生物及其代謝產物的活菌制劑［7］。微生態制劑有無耐藥性、無殘留特點而成為替代抗生素的良好選擇。本文突破以往微生態制劑只注重營養作用觀點，從抗菌性能評價微生態菌株，研究飼用抗生素的替代品，減少使用抗生素所引起的食品安全、病原菌耐藥性和環境問題。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 菌株 芽孢桿菌篩選試驗前處理菌株:N9、枯草芽孢桿菌(媽咪愛)、地衣s、冷1#、納豆1、納豆4、BT123、蠟樣芽孢桿菌。

候選菌株:納豆2、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌B7348、丁酸梭菌。

芽孢桿菌初篩病原性指示菌:豬大腸桿菌1565、藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌。

芽孢桿菌復篩病原性指示菌:雞大腸桿菌1565、豬大腸桿菌2116、雞傷寒沙門氏菌C79－20、雞白痢沙門氏菌C79－13、豬大腸桿菌249、金黃色葡萄球菌。

乳酸菌篩選試驗菌株:嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌(LP)、戊糖片球菌(PP)、嗜熱鏈球菌、乳酸鏈球菌、RDH 乳球菌。

乳酸菌篩選試驗病原性指示菌:雞大腸桿菌1565、豬大腸桿菌2116、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌N9、地衣芽孢桿菌s、B7348(實驗室保存菌株)。

2.1.2 培養基 MRS 培養基，營養肉湯培養基。

2.1.3 試驗器材 XSS－600 顯微鏡，500 型恒溫培養箱，JHT 型凈化工作臺，LD5－2A 型離心機，pHS－3C 型精密pH 計，BC－163K 型冰箱，GUJS－7A 型實驗發酵罐，TCYQ 型恒溫振蕩器，LD4－40 型離心機，FA1004 型電子天平，UV－2000 型紫外可見分光光度計等。

2.1.4 其他材料 海蘭褐雛公雞，AA+白羽肉雞，乳酸菌發酵物及抗生素氧氟沙星(2%)、阿散酸。安全性試驗基礎日糧(玉米64%，豆粕28%，魚粉3%，蛋雞預混料5%)。免疫效率試驗基礎日糧(玉米59.67%，大豆粕35%，石粉1.4%，磷酸氫鈣1.5%，蛋氨酸0.1%，賴氨酸0.1%，植物油1.6%，食鹽0.3%，氯化膽堿0.1%，肉雞－微量0.2%，肉雞－多維0.03%)。

2.2 試驗方法

2.2.1 芽孢桿菌初篩 (1)試驗菌株前處理:芽孢桿菌屬菌株用培養基(1.5%葡萄糖，3.0%黃豆餅粉，0.2%蛋白胨，0.1%NaCl，0.5% (NH4)2SO4，0.6%CaCO3，0.6%MgSO4)30 ℃、pH為7.2～7.5 下液態培養48 h 后，芽孢生成率達10%可用于試驗。按無菌操作取試驗菌培養液10000 rpm 離心10 min，取上清液待用。病原性指示菌由培養基(0.2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.5%牛肉膏)在pH 7.0，37 ℃下液態培養24 h。培養所得病原性指示菌試驗前稀釋100 倍。(2)微生態制劑菌株的篩選抑菌試驗:每個平板上放置牛津杯，杯間距離相等。取雙層培養基平板，每個小杯加滿上清液，培養36 h 觀察并測量抑菌圈直徑。

2.2.2 芽孢桿菌復篩 通過初篩，確定復篩范圍，增加候選菌株作為篩選來源。對初篩中有抑菌作用的菌株培養，培養條件同初篩。培養后的芽孢桿菌，經10000 rpm 離心10 min，取上清液，置4 ℃保存備用。選取指示菌在試驗前經24 h 培養，660 nm 測定光密度值。試驗前稀釋100 倍，以光密度值0.2～0.3為宜。復篩菌株抑菌試驗同初篩。

2.2.3 pH 值對芽孢桿菌抑菌效果影響 試驗用菌株(地衣s和芽孢桿菌B7348)培養條件同復篩，結束培養后，芽孢生成率達10%可用于試驗。按無菌操作將發酵液pH 調為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，10000 rpm 離心10 min，取上清液待用?？瞻着囵B基pH 調為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，10000 rpm 離心10 min，取上清液待用。

2.2.4 復篩菌株的產酶性能試驗 用福林法測定B7348、冷1#和N9 的中性蛋白酶活力。

2.2.5 乳酸菌的篩選 乳酸菌用MRS 液體培養基，37℃培養24 h，10000 rpm 離心分離菌體和上清液。指示菌用營養肉湯培養基，37℃搖床培養24 h。用牛津杯法測定各乳酸菌菌株對指示菌抑菌效果。

2.2.6 乳酸菌耐受試驗 (1)乳酸菌酸耐受試驗:用100 mL 鹽水瓶裝量培養基100 mL，接種LP、嗜酸乳桿菌、PP 試驗菌株，37℃搖床低速培養24 h。將發酵液用HCl 調pH為2.0、2.5、3.0，37℃培養，每隔0.5h取樣計數。

(2)乳酸菌膽鹽耐受試驗:用100 mL 鹽水瓶裝量培養基100 mL，接種上述三種菌株，37℃搖床低速培養24 h。將發酵液豬膽鹽濃度調成0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37℃培養10 min，取樣計活菌總數。

2.2.7 后備菌株代謝產物中有效抑菌成分初步分析 用SDS－PAGE 方法分析。膠濃度為15%，樣品上樣量20μL，Maker 上樣量10μL。芽孢桿菌菌體、芽孢桿菌培養液、芽孢桿菌培養液10000 rpm 離心5 min，取上清液。加至1、2、3 泳道分析。乳酸菌菌體、乳酸菌培養液、乳酸菌培養液10000 rpm 離心5 min，取上清液。加至4、5、6 泳道分析。

2.2.8 菌種安全性試驗 將B7348 發酵后噴霧干燥，制成噴干菌粉。將LP－11 發酵后真空冷凍干燥，制成凍干菌粉。對兩種菌粉進行計數。分別稀釋成含1×108個活菌菌粉。將供試菌種加到實驗動物的基礎日糧中，添加比例為0.5‰(1 組)、1‰(2 組)、2‰(3 組)、5‰(4 組)、10‰(5 組)。

試驗動物以基礎日糧預飼一周，稱重后隨機分十個試驗組和一個對照組，其中五個組添加B7348，為7(1)、7(2)、7(3)、7(4)、7(5)組;五個組添加LP－11，為N(1)、N(2)、N(3)、N(4)、N(5)組;對照組不加菌粉，每組樣本20 只。經兩周生長試驗，稱重計算增重率并解剖觀察器官。

2.2.9 菌種免疫效率試驗 AA+白羽肉雞120 只，隨機均分為四組。一組空白(Ck 組:不添加菌種和抗生素)，兩組添加供試菌種(Ⅰ、Ⅱ組為添加不同劑量供試菌種組)，一組添加抗生素(Ⅲ)。使用雞沙門氏菌染毒并觀察發病率和病死率。各試驗組日糧組成及含量見表1。

表1 各試驗組日糧組成及含量Table 1 The composition and content of diet group

3 結果與分析

3.1 芽孢桿菌初篩

芽孢桿菌初篩結果見表2。

表2 芽孢桿菌初篩結果Table 2 The results of Bacillus early sifting

初篩試驗發現:枯草芽孢桿菌(媽咪愛)、納豆1 對采用的指示菌沒有明顯抑制作用;N9、地衣s、冷1#、納豆4、BT123 至少對兩種指示菌具有明顯抑制作用，蠟樣芽孢桿菌只對金黃色葡萄球菌有抑制作用。

3.2 芽孢桿菌復篩

芽孢桿菌復篩結果見表3。

表3 10株芽孢桿菌對指示菌的抑菌效果(單位:mm)Table 3 The antibacterial effect of 10 strains of bacillus instructions(unit:mm)

表3 有5株芽孢桿菌對指示菌產生相對較強的抑菌作用，即冷1#、地衣s、納豆2、N9、7348。

表4 復篩后五株芽孢桿菌的抑菌圈(單位:mm)Table 4 Five strains bacillus bacteriostatic circle after seconf sifting(unit:mm)

表4:5株芽孢桿菌對6 種指示菌有不同程度的抑菌作用，枯草芽孢桿菌B7348 對革蘭氏陽性致病菌－金黃色葡萄球菌，抑制效果十分明顯。

3.3 pH 值對芽孢桿菌抑菌效果影響

(1)不同pH 值對地衣s 抑菌效果的影響

以抑菌圈平均值(X)表示不同pH 值對地衣s 的抑菌效果，見表5。

表5 pH 值對地衣s 抑菌效果的影響(mm)Table 5 The antibacterial effect about pH on Bacillus Licheniformis s(mm)

在所設的pH 值下:地衣s 對藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌均具有不同程度的抑菌作用，而且對金黃色葡萄球菌的抑制能力比對藤黃八疊球菌強;而對大腸桿菌、沙門氏菌無抑菌作用。

(2)不同pH 值對B7348 抑菌效果的影響

不同pH 值對B7348 抑菌效果以抑菌圈平均值(X)表示，見表6。

表6 pH 值對B7348 抑菌效果的影響(mm)Table 6 The antibacterial effect about pH on B7348(mm)

在所設pH 值下:B7348 對7 種指示菌有不同程度的抑菌效果;且對同一指示菌，B7348 抑菌效果沒有明顯差別。B7348 的抗菌性對所設pH 不敏感。芽孢菌結束培養后，pH為7.0 左右抑菌效果較好，培養無需調整pH 值。

3.4 復篩菌株的產酶性能試驗

復篩菌株的產酶性能試驗結果見表7。

表7 中性蛋白酶測定結果Table 7 The determination result of neutral protease

表7:B7348 中性蛋白酶活力最高，中性蛋白酶活力可達140 U/mL，明顯高于其他2株篩選菌株。

3.5 乳酸菌的篩選

不同乳酸菌菌株對指示菌菌株的抑菌結果見表8。

表8 不同乳酸菌抑菌效果(單位:mm)Table 8 The bacteriostatic effect of different Lactic acid bacteria

表8:LP、嗜酸乳桿菌、PP 對指示菌中致病菌抑制效果較明顯且對芽孢菌的抑制相對較弱。

3.6 乳酸菌耐受試驗

(1)乳酸菌的酸耐受試驗

乳酸菌酸耐受試驗結果見表9。

表9 不同乳酸菌耐受結果(cfu/ml)Table 9 The result of acid tolerence about different Lactic acid bacteria

表9:該三種乳酸菌在pH 值為2.0 時，2 h 后不能耐受。相較于其他2株菌株，酸的耐受能力尤以植物乳桿菌最強。

(2)乳酸菌的膽鹽耐受試驗。

乳酸菌膽鹽耐受試驗結果見表10。

表10 不同乳酸菌膽鹽耐受結果Table 10 The result of cholate tolerance about different Lactic acid bacteria

表10:膽鹽對三株乳酸菌的生長有一定的抑制作用，在0.2%的膽鹽濃度下，活菌數仍然保持在108，在0.3%、0.4%和0.5%膽鹽濃度下活菌數呈梯度下降趨勢。但戊糖片球菌的耐受性比另兩株乳桿菌強。

通過篩選，考慮菌株抑菌性和生物特性，選擇芽孢桿菌B7348和植物乳桿菌LP－11為后備菌株。芽孢桿菌B7348 對革蘭氏陽性菌抑制效果較好，而植物乳桿菌LP－11 對革蘭氏陰性菌抑制效果明顯，聯合使用效果更佳。芽孢桿菌B7348和植物乳桿菌LP－11 是在現有菌株基礎上篩選得到，培養發酵條件經優化，液體深層發酵過程中能達到109cells/ml和1010cells/ml。

3.7 后備菌株代謝產物中有效抑菌成分初步分析

芽孢桿菌B7348 SDS－PAGE 分析見圖1。乳酸菌LP－11 SDS－PAGE 分析結果見圖2。

圖1 芽孢桿菌B7348 SDS－PAGE 分析Fig.1 The analysis on SDS－PAGE about Bacillus

圖2 乳酸菌LP－11 SDS－PAGE 分析Fig.2 The analysis on SDS－PAGE about Lactic acid bacteria

芽孢桿菌B7348 在8 kd 左右出現三條濃密的條帶，從分子量上分析，此三條帶均為小分子肽類物質。其培養液上清及沉淀中出現此條帶，說明芽孢菌B7348 能分泌出這種活性小肽。對乳酸菌LP－11 的蛋白成分進行分析，結果與芽孢桿菌相似。乳酸菌LP－11 主要成分分子量為3.5 kd 左右，說明該株乳酸菌主要抑菌物質為分子量更小的抗菌肽類物質。通過檢驗抑菌活性，發現乳酸菌LP－11 有較好的抑制指示菌作用。

3.8 菌種安全性分析

飼喂試驗的結果見表11。

表11 增重率實驗結果(%)Table 11 The experimental results of weight increasing rate

經兩周飼喂后，雛雞生長發育正常，觀察雛雞外觀及糞便未見異常。解剖學性狀未見異常，具體見圖3。

圖3 安全性試驗部分臟器Fig.3 The part organs safety test

圖3:添加最高劑量B7348 的5 組的臟器與對照組相比未發現異常，初步斷定用于養殖動物的飼喂是安全的。表11:7(2)7(3)7(4)7(5)N(1)N(3)N(4)等組增重率均高于對照組。

3.9 菌種免疫效率試驗

肉雞染毒后指標見表12。

表12 肉雞染毒后指標Table 12 The index of chiken after poison attack

表12:對照組發病率和病程明顯高于其它各組。從發病率來看，第Ⅱ組、第Ⅲ組相同，低于第Ⅰ組。從病程來看，第Ⅱ組最短，第Ⅰ組和第Ⅲ組相同。病死率第Ⅱ組、第Ⅲ組為0。綜上所述，添加菌種的第Ⅱ組實驗結果最好。

4 結論

篩選出的抑菌性芽孢桿菌B7348和乳酸菌LP－11 無論在菌種安全性還是在免疫效率方面有出色表現，兩者合理搭配可替代飼用抗生素在飼料中的使用。用兩株益生菌及其代謝產物，在提高抵抗力，減少發病率方面，已達到和超過飼用抗生素效果。微生態制劑有抗生素無法比擬的天然優勢，將會成為人們關注的焦點。

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