甘農4號紫花苜蓿愈傷組織原生質體游離條件的研究

張凌云　師尚禮　李玉珠

摘要：以甘農4號紫花苜蓿下胚軸誘導所得愈傷組織為材料，研究酶液組合，滲透壓調節物甘露醇濃度，酶解時間，愈傷組織繼代時間及預處理措施對原生質體游離效果的影響。結果表明：當酶液組合為2%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.3%半纖維素酶，滲透壓為0.6 mol/L甘露醇，愈傷組織繼代培養時間為12 d，預處理措施為在CPW11溶液中預質壁分離1 h，酶解時間10～12 h時，游離出的原生質體產量最高，可達3.34×106 個/g，原生質體活力高達82.8%。

關鍵詞：甘農4號紫花苜蓿；愈傷組織；原生質體；酶解條件

甘農4號紫花苜蓿（Medicago sativa cv.Gannong No.4）是從6個歐洲苜蓿品種中選擇多個優良單株，經母系選擇法選育而成。該品種株型緊湊直立，莖枝多，節間長，草層整齊，在初期生長快，可提高建植第1年的草產量，生態適應性廣泛，適宜在西部大部分地區栽培。但該品種也存在抗逆性差，病蟲害嚴重，木質素含量高等缺點[1]。

植物原生質體可以由植物原生質體通過酶解大量獲得，且具有全能性，可融合性，可轉化性，所以是進行作物改良的有效途徑之一[2]。在苜蓿中已有許多關于原生質體培養獲得再生植株[3-6]、原生質體融合[7，8]以及轉基因技術應用[9，10]等方面的報道。但是對甘農4號紫花苜蓿的報道僅限于愈傷組織培養再生植株的報道[11，12]。因此，以甘農4號紫花苜蓿愈傷組織為實驗對象，研究酶解因素對其原生質體分離效果的影響，優化酶解條件，為甘農4號紫花苜蓿品種改良奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甘農4號紫花苜蓿種子由甘肅農業大學草業學院提供。

將成熟飽滿的種子先在蒸餾水中浸泡30 min，再用0.1%升汞溶液浸泡10 min，然后，用酒精溶液浸泡1 min，最后在無菌水中洗滌3～5次后接種在1/2MS培養基上，培養條件為25 ℃，2 500 lx，16 h光周期[13，14]。待子葉完全展開而真葉尚未長出時，將下胚軸剪切為3～5 mm節段，于MS+2.0 mg/L 2，4D +1.5 mg/L 6BA+1.5 mg/L NAA培養基中誘導愈傷組織[10，15]，待形成穩定的細胞培養系后，挑選色澤鮮艷，組織結構明顯的愈傷組織（圖1），用于原生質體游離實驗。

1.2 原生質體的分離與純化

酶解液由不同濃度的纖維素酶，果膠酶，離析酶，崩潰酶及半纖維素酶組成（表1），并溶于CPW11溶液中（配方為27.2 mg/L KH2PO4，101.0 mg/L KNO3，1 480.0 mg/L CaCl2·2H2O，246.0 mg/L MgSO4·7H2O，0.16 mg/L KI，0.025 mg/L CuSO4·5H2O，5.0 mmol/L MES，甘露醇濃度為11%），pH調至5.8～5.9，用0.22 μm的微孔濾膜過濾滅菌后備用。

稱取1 g愈傷組織置于盛有10 mL酶液的三角瓶，在25 ℃，50 r/min的搖床黑暗培養。酶解結束后將三角瓶內的液體依次經100目、400目尼龍網篩過濾，濾液收集在15 mL離心管內，800 r/min離心7 min，收集底部沉淀的原生質體，再依次用CPW11溶液和KM8P溶液洗滌2～3次，得到純化的原生質體[12，16-18]。

1.3 酶解條件的篩選

分別對酶液滲透壓、酶解時間、愈傷組織繼代時間和預處理措施4個影響原生質體分離的主要酶解條件進行實驗。以甘露醇為酶液滲透壓的調節物，設0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70 mol/L共6個濃度進行實驗；再對酶解持續的時間設6、8、10、12、14、16 h共6個處理進行篩選；之后以繼代培養至6、8、10、12、14、16 d的愈傷組織作為酶解材料；設置暗培養（0 lx、24 h），低溫培養（4 ℃、24 h）、質壁分離（CPW11溶液中浸泡1 h）及對照（25 ℃、光周期16 h）4個預處理措施進行篩選[12，19-21]。篩選時以不同處理中原生質體產量及活力為衡量依據，得出最佳酶解條件。

1.4 原生質體產量及活力的測定

用血球計數器測定原生質體產量。吸取少量純化后的原生質體懸浮于血球計數板上，于顯微鏡下觀察統計原生質體個數（中央大方格內25個中方格里的細胞數）。原生質體活力的測定采用熒光染料熒光素雙醋酸鹽（FDA）活體染色法。FDA用丙酮配制5 mg/mL溶液，吸取25 μL/mL與原生質體懸浮液混合均勻。取1滴染色后的原生質體懸浮液滴在載玻片上，靜置5 min后于熒光顯微鏡下觀察其活力[22]。觀察時隨機選取視野，統計視野中發綠色或黃綠色熒光的細胞數。

1 mL懸浮液中原生質體個數= 1個方格懸浮液（0.1 mm3，即0.1 μL）中的細胞數×10×1000

原生質體產量（個/g）=原生質體密度（個/mL）×原生質體懸浮液的總體積（mL）/材料總質量（g）

原生質體活力=（有活力的原生質體個數/原生質體總數）×100%

2 結果與分析

2.1 酶液組合對原生質體分離的影響

以不同濃度的纖維素酶，果膠酶，離析酶，崩潰酶和半纖維素酶組合成5種酶液，酶解時均挑選新鮮培養基上的愈傷組織并保持其他酶解條件一致，在此條件下比較5種酶液組合對原生質體分離效果的影響。結果表明（圖2），Ⅰ是酶成分最單一的酶液組合，原生質體產量和活力最低，為1.41×106 個/g和53.7%，其余酶組合均是在Ⅰ基礎上添加其他水解酶組成，效果均優于Ⅰ。其中，Ⅳ的原生質體產量和活力最高，為2.75×106 個/g和71.6%；Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ相比，Ⅴ的酶種類豐富，游離出的原生質體產量和活力（2.35×106 個/g，65.4%）相對較高，而Ⅱ、Ⅲ游離出的原生質體產量和活力相對較低，分別為1.95×106 個/g、1.57×106 個/g和64.7%、54.7%。綜上可說明Ⅳ中所含的0.3%半纖維素酶有利于甘農4號紫花苜蓿愈傷組織游離原生質體，顯著提高了原生質體產量和活力，而0.3%離析酶和0.3%崩潰酶對甘農4號紫花苜蓿愈傷組織原生質體游離的效果較差。因此，2%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.3%半纖維素酶是最適宜甘農4號紫花苜蓿愈傷組織原生質體游離的酶液配比。

2.2 甘露醇濃度對原生質體分離的影響

酶液中甘露醇濃度不同，使浸泡懸浮在其中的植物細胞滲透壓不同，從而影響原生質體分離效果。結果表明（圖3），在不同濃度處理中，隨著甘露醇濃度的增加，原生質體產量逐漸增加，原生質體活力也緩慢提高，當甘露醇濃度為0.6 mol/L時，原生質體產量和活力達到最大值，分別為2.77×106 個/g和71.8%，此時的原生質體產量和活力顯著高于其他濃度水平，且游離出的原生質體邊緣清晰，碎片少，細胞完整度高。之后原生質體產量和活力隨甘露醇濃度的增加而顯著降低，并伴隨產生大量細胞碎片。由此說明濃度為0.6 mol/L的甘露醇為最佳酶液滲透壓調節濃度。

2.3 酶解時間對原生質體分離的影響

酶解時間的不同對原生質體產量、活力和細胞完整性產生顯著影響。在最佳酶組合和甘露醇濃度基礎上設6個不同酶解時間，結果表明（圖4），當酶解時間延長時，原生質體的產量和活力均先逐漸增加，后緩慢降低。酶解時間小于8 h時，游離出的原生質體產量和活力較低，分別為1.96×106 個/g和55.4%，均不能有效游離出大量原生質體，說明酶解時間不夠充分。當酶解延長至10 h時，原生質體產量和活力達到最高，為2.98×106 個/g和75.2%，其中，原生質體產量僅與酶解12 h的產量（2.85×106個/g）相似且顯著高于其他酶解時間，而活力顯著高于酶解12 h（71.9%）及其他酶解時間。說明酶解10～12 h愈傷組織與酶解液反應充分，能解離出大量有活力的原生質體，因此，甘農4號紫花苜蓿愈傷組織的最佳酶解時間為10～12 h。

2.4 愈傷組織繼代培養時間對原生質體分離的影響

以2%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.3%半纖維素酶+0.6 mol/L甘露醇，酶解10～12 h為基礎，設6個愈傷組織繼代時間梯度，研究不同繼代時間對愈傷組織原生質體分離的影響。結果表明（圖5），愈傷組織繼代8～12 d原生質體產量和活力的增加趨勢顯著，而繼代14～18 d雖然愈傷組織的體積增大細胞數量增多，但原生質體的產量和活力逐漸降低，說明細胞逐漸趨于衰老死亡。繼代至12 d時原生質體產量和活力達到最大值，為3.17×106 個/g和78.4%，顯著高于其他繼代梯度，且獲得的原生質體飽滿完整，因此認為繼代至12 d的甘農4號紫花苜蓿愈傷組織最適宜進行酶解。

2.5 預處理措施對原生質體分離的影響

2%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.3%半纖維素酶+0.6 mol/L甘露醇酶解10～12 h，愈傷組織繼代12 d的基礎上對預處理條件進行實驗，結果表明（表2），愈傷組織在CPW11溶液中經過1 h的質壁分離處理對原生質體的游離有明顯促進作用，其原生質體產量和活力（3.34×106個/g，82.8%）顯著高于對照處理（3.18×106個/g，78.5%）；而暗處理和低溫處理的原生質體產量和活力分別為2.64×106個/g，2.90×106個/g和72.3%，73.3%，均低于對照，說明暗處理和低溫處理對原生質體的游離并未產生促進作用。因此CPW-11溶液中預質壁分離1 h是甘農4號紫花苜蓿愈傷組織原生質體分離最佳的預處理措施。

3 討論

3.1 酶液組合成分，滲透壓及酶解時間對原生質體分離的影響

植物原生質體是指脫去了植物細胞特有的細胞壁，僅僅由質膜包裹著的裸露細胞[2，9]，因此，原生質體分離的關鍵是酶解去除細胞壁，而獲得完整的細胞。其中，影響細胞壁酶解的主要因素是酶液種類、濃度和酶解時間，由于供試材料的種類差異，適宜的酶種類及濃度、酶解時間各不相同[12，17-21]。

采用纖維素酶、果膠酶、離析酶、崩潰酶、半纖維素酶進行酶液組合實驗，發現2%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.3%半纖維素酶為最佳酶液配比，所獲得的原生質體產量多活力強，這與王娟等[19]以阿爾岡金苜蓿愈傷組織為材料酶解原生質體所用的最佳酶液配比有所不同，這一結果說明雖然實驗材料均為苜蓿，但適宜不同的苜蓿品種的酶液組合不同。甘農4號紫花苜蓿愈傷組織在上述酶液組合中酶解10～12 h獲得的原生質體產量和活力為最高值，若酶解過短則不能充分釋放原生質體，而酶解時間過長原生質體長時間浸泡在酶解液中，從而導致質膜破裂，降低原生質體產量和活力，這與陶茸等[20]在研究扁蓿豆原生質體酶解條件的結果相似。

以適當濃度的甘露醇作為滲透壓調節物，能有效控制脫壁后的細胞保持完整性，防止原生組織發生破裂，從而提高原生質體活力。目前，建立的各種植物原生質體分離體系中，以0.35～0.80 mmol/L[22]的滲透壓濃度為適，其中，草地早熟禾要求0.4 mol/L甘露醇[23]，百脈根里奧愈傷組織適宜濃度為0.55 mol/L[12]。不同苜蓿品種對滲透壓的要求也不同，南方紫花苜蓿子葉及子葉愈傷組織要求甘露醇濃度為0.4 mol/L[5]，舒文華等[6]利用苜蓿葉片游離原生質體適宜的甘露醇濃度為0.6 mol/L，這一結果與此次實驗的結果一致。

3.2 愈傷組織繼代時間及預處理措施對原生質體分離的影響

愈傷組織的繼代培養是將生長至一定時間、狀態良好的愈傷組織轉移到新鮮的培養基中繼續增殖生長，以保持其鮮活的狀態，而在增殖過程中愈傷組織的生理狀態隨時間延長而發生變化，因此，對原生質體的游離效果產生一定影響。植物種類或品種不同，愈傷組織的生長速度和繼代時間不同，在張改娜[7]對3種豆科牧草原生質體分離培養的研究中發現，駱駝刺發根農桿菌A4轉化系愈傷組織的最佳繼代時間為8 d，而甲硫氨酸抗性系鷹嘴紫云英愈傷組織繼代時間卻以12 d為宜，此次實驗所得的結果表明，甘農4號紫花苜蓿愈傷組織繼代最佳時間為12 d。

適當的預處理措施可以有效的改善細胞生理狀態或減輕細胞膜在酶解時的損傷，從而提高原生質體產量、活力和完整性。實驗在酶解前將材料于CPW11溶液中浸泡1 h，使細胞壁內的原生質體部分收縮，改變細胞膜結構，減小酶解時細胞壁破損面積，從而有效提高了原生質體產量和活力。這一結果與陶茸等[21]對隴東野生紫花苜蓿原生質體分離預處理結果相似。

4 結論

對甘農4號紫花苜蓿愈傷組織進行原生質體分離，篩選了適宜的酶解條件。即最佳酶液組合為2%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.3%半纖維素酶，滲透壓調節劑為0.6 mol/L甘露醇，酶解時間為10～12 h，愈傷組織繼代時間為12 d，最佳預處理措施為酶解前將酶解材料在CPW11溶液中預質壁分離1 h，此時原生質體產量和活力分別高達3.34×106 個/g，82.8%。

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