乙型肝炎病毒對肝內(nèi)TGF-β1/Smads信號通路的作用*

張香梅， 樂曉華， 陳培芬， 茍繼周， 孫 炎， 鐘荀珍， 周亞敏， 劉曉玲， 陳青山△

(1深圳市第三人民醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518112； 2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

乙型肝炎病毒對肝內(nèi)TGF-β1/Smads信號通路的作用*

張香梅1， 樂曉華1， 陳培芬1， 茍繼周1， 孫 炎1， 鐘荀珍1， 周亞敏2， 劉曉玲2， 陳青山2△

(1深圳市第三人民醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518112；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

目的探討乙型肝炎病毒(HBV)對肝內(nèi)TGF-β1蛋白表達及Smads信號通路的作用，為制定慢性乙肝肝纖維化臨床治療策略提供理論依據(jù)。方法(1)運用免疫組化PV-6000法檢測對照組和慢性乙肝組肝組織中TGF-β1、HBsAg和HBcAg的表達，并采用熒光定量PCR法測定慢性乙肝患者血清HBV DNA含量。(2)應(yīng)用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)HBV刺激的人肝星狀細胞系LX-2細胞，Western blotting方法測定其細胞內(nèi)TGF-β1、Smad3和Smad7的蛋白表達。結(jié)果(1)慢性乙肝組肝組織內(nèi)TGF-β1的表達高于對照組(P<0.01)；肝內(nèi)TGF-β1表達水平與血清HBV DNA含量呈正相關(guān)(P<0.01)，且HBcAg陽性肝組織水平較高(P<0.01)。(2)體外細胞學(xué)實驗中，HBV刺激組LX-2細胞內(nèi)TGF-β1和Smad3蛋白含量高于對照組和HBV+抗-TGF-β1組(P<0.01)；Smad7蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論(1)TGF-β1在慢性乙肝患者肝組織中的表達與血清HBV DNA含量及肝內(nèi)HBcAg的表達有關(guān)。(2)在TGF-β1/Smads信號通路中，HBV致纖維化作用機制以Smad3的正性調(diào)控為主，Smad7的作用不明顯。

乙型肝炎病毒； 轉(zhuǎn)化生長因子 β1； Smad蛋白類； 肝纖維化

我國人群對乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)具有較高的感染率，絕大多數(shù)HBV慢性感染人群都有不同程度的肝纖維化(hepatic fibrosis)表現(xiàn)，其中10%～15%在5～10年內(nèi)可發(fā)展成為肝炎后肝硬化或肝細胞癌[1-2]。已有研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)及Smads信號通路與器官纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。本研究結(jié)合臨床資料，運用分子生物學(xué)、細胞學(xué)等方法，探討HBV對肝內(nèi)TGF-β1蛋白表達和TGF-β1/Smads信號通路中關(guān)鍵蛋白Smad3、Smad7的影響，為臨床阻抑或延緩慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)肝纖維化、肝硬化的發(fā)生提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

隨機收集深圳市第三人民醫(yī)院病理科2008～2012年間經(jīng)臨床及病理學(xué)證實為慢性乙型病毒性肝炎的肝穿刺活檢石蠟包埋組織標(biāo)本99例。選取10例無HBV及其它病原體感染的正常肝組織作為對照。乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)由凱杰生物工程(深圳)有限公司生產(chǎn)；HBsAg、HBcAg抗體和PV-6000免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人TGF-β1多克隆抗體和鼠抗人Smad3、Smad7單克隆抗體購自Santa Cruz；PVDF膜和化學(xué)發(fā)光液購自Pierce。體外細胞學(xué)實驗所用HBV來自我院1例慢性乙型肝炎患者的血清，蔗糖密度梯度離心法純化濃縮后HBV DNA終濃度為1.74×1011IU/L。該血清的使用已征得患者本人同意。

2方法

2.199例慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA含量測定 實驗所用試劑為乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，方法為PCR-熒光探針法。實驗嚴格按照試劑盒操作說明進行，反應(yīng)體系設(shè)為40 μL：HBV PCR反應(yīng)液37.6 μL，Taq酶0.4 μL，尿嘧定DNA糖苷酶(uracil DNA glycosylase,UNG) 0.06 μL，模板cDNA 2 μL。循環(huán)條件：37 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。熒光信號收集設(shè)在60℃。實驗用儀器為ABI7500擴增儀。

2.2免疫組織化學(xué)法檢測HBsAg、HBcAg和TGF-β1蛋白在慢性乙肝患者肝組織中的表達 運用免疫組化PV-6000法分別檢測對照組和慢性乙肝組肝組織中TGF-β1、HbsAg和HBcAg的表達。HBsAg和HBcAg檢測抗體為工作液，TGF-β1抗體工作濃度為1∶120。DAB顯色后，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封固。PBS液取代Ⅰ抗作陰性對照。其染色結(jié)果以著色強度及陽性細胞數(shù)綜合評分：(1)著色強度：無色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分；(2)陽性細胞數(shù)：≤25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。2項得分相加為其總得分。≤2分為陰性，3～4分為陽性，>4分為強陽性，強陽性判定為高表達。最終結(jié)果由2位病理醫(yī)師采用雙盲法觀察所得。

2.3人肝星狀細胞系LX-2細胞的培養(yǎng)并用MTT實驗檢測細胞的增殖能力 實驗分為3組：(1)對照組；(2)HBV組；(3)HBV+抗TGF-β1組。其中第(2)組在加入純化HBV后HBV的終濃度為1.74×109IU/L，第(3)組培養(yǎng)基內(nèi)TGF-β1抗體終濃度為5 μg/L。取對數(shù)生長期的上述各組LX-2細胞，胰酶消化后用含10%FCS-DMEM培養(yǎng)基調(diào)整上述各組細胞，以每孔約5×103個LX-2細胞接種于96孔板，每孔體積200 μL，同時設(shè)空白對照(僅加培養(yǎng)基)。培養(yǎng)約36～48 h后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸干上清，每孔加二甲基亞砜150 μL，在酶標(biāo)儀492 nm波長測定吸光度值。根據(jù)實驗組/對照組吸光度(A)比值表示細胞增殖能力大小。獨立實驗2次，每次每組取5個復(fù)孔，求平均值。

2.4Western blotting方法測定不同處理組LX-2細胞中TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白的表達 實驗分組同上。將生長狀態(tài)良好的LX-2細胞(1×108/L濃度)接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，在第(2)組培養(yǎng)孔加入純化HBV，在第(3)組培養(yǎng)孔加入5 μg/L濃度的抗TGF-β1抗體后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集上述各組細胞，于冰上細胞裂解液中裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清用BCA法進行蛋白定量。取20 μg蛋白，選用10%分離膠和5%濃縮膠進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，分別用1∶400兔抗人TGF-β1多克隆抗體、1∶1 000的鼠抗人Smad3單克隆抗體和1∶500的鼠抗人Smad7單克隆抗體室溫孵育1 h后4 ℃過夜，次日洗膜后分別加酶標(biāo)記的羊抗兔或抗鼠抗體(1∶4 000)室溫孵育1 h后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測，X膠片掃描后測定各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計分析：計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析，樣本均數(shù)間的多重比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1基本資料

本研究選取的99例慢性乙肝患者中，男性83例，占83.8 %，平均年齡(36.10±8.26)歲；女性16 例，占16.2 %，平均年齡(37.31±8.81)歲。99例乙肝患者血清中HBV DNA含量：HBV DNA≤1×106IU/L，20例；1×1061×1010IU/L，28例。免疫組化法檢測99例肝穿組織中HBsAg和HBcAg的表達，結(jié)果顯示：99例肝穿組織中HBsAg均為陽性表達，HBcAg陽性表達者58例，陰性表達者41例。

2TGF-β1在慢性乙肝患者肝組織中的表達及其與血清HBVDNA含量和肝內(nèi)HBcAg表達的關(guān)系

免疫組化PV-6000法檢測結(jié)果顯示，TGF-β1在正常肝組織中不表達或弱表達，在慢性乙肝患者肝組織中呈不同程度的黃色或棕黃色表達，主要表達于肝星狀細胞胞漿內(nèi),見圖1。TGF-β1在乙肝患者肝內(nèi)的表達水平高于對照組(P<0.05)，見表1；肝內(nèi)TGF-β1表達水平隨著乙肝患者血清HBV DNA含量的增高而增加(P<0.01)；HBcAg陽性肝組織中TGF-β1的表達高于HBcAg陰性肝組織(P<0.01)，見圖1、表2。

Figure 1. Expression of intrahepatic TGF-β1in control and chronic hepatitis B (CHB) groups (immunohistochemical staining using PV-6000 method, scale bars=50 μm). A: control group; B, C, D: CHB group, with serum HBV DNA content at 1.44×106, 1.24×108and 1.52×1010IU/L, respectively; E: intrahepatic HBcAg (-), with serum HBV DNA content at 1.00×106IU/L; F: intrahepatic HBcAg (+), with serum HBV DNA content at 1.00×106IU/L.

圖1TGF-β1在對照組和慢性乙肝組肝組織中的表達

表1慢性乙肝組與對照組肝組織TGF-β1的表達

Table 1. The expression of intrahepatic TGF-β1in control and CHB groups(Mean±SD)

GroupnTGF-β1Control101.20±0.92CHB993.09±1.71**

**P<0.01vscontrol.

3HBV對LX-2細胞體外增殖能力的影響

MTT結(jié)果顯示，對照組、HBV組和HBV+抗-TGF-β1組各孔測定的A值分別為 0.22±0.00、1.06±0.04和0.23±0.01，HBV組高于對照組和HBV+抗TGF-β1組(P<0.01)，其余差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表299例慢性乙肝患者肝組織TGF-β1表達與肝細胞內(nèi)HBcAg、血清HBVDNA含量的關(guān)系

Table 2. The relationship between intrahepatic TGF-β1expression with hepatocellular HBcAg and serum HBV DNA content in 99 cases of chronic hepatitis B patients (Mean±SD)

IndicatorLevelnTGF-β1LiverHBcAg(+)584.09±1.26*(-)411.68±1.21SerumHBV-DNA(IU/L)<1×106200.90±1.021×106～1×108252.72±1.31#1×108～1×1010263.85±1.05#>1×1010284.29±1.30#

*P<0.05vsHBcAg(-);#P<0.05vsHBV DNA<1×106IU/L.

4HBV對LX-2細胞TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白表達的影響

運用Western blotting方法檢測TGF-β1、Smad3蛋白和Smad7蛋白在對照組、HBV組和HBV+抗TGF-β1組細胞中的表達。3組中，TGF-β1和Smad3蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，HBV組高于對照組和HBV+抗-TGF-β1組(P<0.05)，其余差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Smad7蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 2. Expression of TGF-β1, Smad3 and Smad7 in LX-2 cells detected by Western blotting.Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsHBV.

圖2Westernblotting法檢測TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白在3組細胞中的表達

討 論

慢性HBV感染所致肝纖維化是目前我國乙肝患者所面臨的嚴重健康問題，探明HBV在肝纖維化形成中的作用，對有效防治乙肝肝纖維化尤為重要。

本研究首先檢測TGF-β1在慢乙肝患者肝組織中的表達，并分析其表達與乙肝患者同期測定的血清HBV DNA含量的關(guān)系，結(jié)果顯示，TGF-β1在乙肝肝組織中的表達高于正常肝組織、表達量與血清HBV DNA含量呈正相關(guān)關(guān)系，這與賴婭芳等[5]得出的結(jié)論一致。

肝組織內(nèi)HBcAg不僅是HBV存在的直接標(biāo)志，而且是判斷HBV的存在和復(fù)制狀態(tài)的重要指標(biāo)[6]。本研究結(jié)果表明TGF-β1蛋白在HBcAg陽性肝組織中的表達水平高于HBcAg陰性的肝組織，尤其在HBcAg漿型表達的肝組織內(nèi)TGF-β1表達更明顯，提示HBV有可能通過直接或間接的方式誘導(dǎo)肝內(nèi)細胞因子TGF-β1的表達。

在TGF-β1/Smads信號通路中，肝星狀細胞是該通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵細胞，Smads蛋白則是該通路的主要組成部分，對TGF-β1信號通路激活狀態(tài)的維持及調(diào)節(jié)至關(guān)重要[7]。已有研究顯示，在Smads蛋白家族中，Smad3是目前已知TGF-β1通路發(fā)揮作用，啟動下游靶基因表達的重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[8-9]，而Smad7主要抑制TGF-β1信號通路，對Smads信號起著負調(diào)控作用[10-11]。在肝臟損傷過程中，肝星狀細胞的活化可來自于TGF-β1的旁分泌和自分泌，活化的肝星狀細胞可分泌更大量的TGF-β1，從而促進及維持肝星狀細胞的進一步活化[12-13]。體外細胞學(xué)實驗所用的LX-2細胞來源于正常人肝臟中分離的、經(jīng)轉(zhuǎn)染SV40T質(zhì)粒后培養(yǎng)篩選的肝星狀細胞，它能更好地模擬人體肝星狀細胞的特性，使實驗結(jié)果更加接近真實水平[14]。實驗結(jié)果表明，當(dāng)在培養(yǎng)基內(nèi)加入HBV血清并培養(yǎng)24 h后時，不但LX-2細胞的增殖能力增加(肝星狀細胞的活化標(biāo)志之一)，其TGF-β1和Smad3蛋白含量較加入前明顯增加，這與已往研究得出的“HBV可促進人肝星狀細胞系LX-2細胞TGF-β1的表達及細胞增殖”的結(jié)論相一致[15]。但在培養(yǎng)液中加入抗TGF-β1抗體一定時間(約16 h)后，LX-2細胞內(nèi)TGF-β1和Smad3蛋白含量基本恢復(fù)到未加入HBV血清時的水平，原因可能是加入的抗TGF-β1抗體中和了活化的肝星狀細胞分泌至培養(yǎng)液中的TGF-β1，從而部分或完全阻止了TGF-β1與肝星狀細胞膜上的TGF-β1受體結(jié)合，消弱或阻止了HBV對肝星狀細胞的作用及對TGF-β1/Smads信號通路的影響。Smad7蛋白表達在整個實驗過程中變化不明顯，提示TGF-β1/Smads信號通路在慢乙肝肝纖維化形成中的作用主要是通過Smad3的正性調(diào)控為主，Smad7的負性調(diào)控機制作用不明顯，這和以往研究所認為的Smad7是TGF-β1/Smads信號通路中主要的抑制性調(diào)控蛋白，肝損傷時TGF-β1可快速誘導(dǎo)Smad7的表達不一致[14]。

可見，HBV的存在及復(fù)制對慢乙肝患者肝纖維化的形成與發(fā)展至關(guān)重要，TGF-β1/Smads信號通路中HBV致纖維化作用以Smad3的正性調(diào)控為主。因此，在慢乙肝抗纖維化的治療中，既要動態(tài)監(jiān)測乙肝患者體內(nèi)HBV DNA復(fù)制水平適時進行抗病毒治療，又要積極針對TGF-β1和Smad3進行靶向治療，阻抑或延緩肝纖維化或肝硬化的發(fā)生。

[1] Lu FM,Zhuang H. Management of hepatitis B in China[J]. Chin Med J (Engl), 2009,122(1):3-4.

[2] Mulrooney-Cousins PM,Michalak TI. Persistent occult hepatitis B virus infection: experimental findings and clinical implications[J]. World J Gastroenterol, 2007,13(43):5682-5686.

[3] Henderson NC, Forbes SJ. Hepatic fibrogenesis:from within and outwith[J]. Toxicology, 2008,254(3):130-135.

[4] Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J]. Gastroenterology, 2008,134(6): 1655-1669.

[5] 賴婭芳，楊 巖，盛慧萍. 慢性乙型肝炎患者血清中TNF-γ、IL-10、TGF-β1水平與HBV-DNA載量的關(guān)系[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2010,32(2):211-213.

[6] 徐志強,成 軍, 張鴻飛.HBcAg生物學(xué)特性研究進展[J].世界華人消化雜志, 2004,12(12):2833-2836.

[8] Lin YL, Lin CY, Chi CW, et a1. Study on anti-fibrotic effects of curcumin in rat hepatic stellate cells [J]. Phytother Res, 2009,23(7):927-932.

[9] Uemura M, Swenson ES, Gaca MD, et al. Smad2 and Smad3 play different roles in rat hepatic stellate cell function and alpha-smooth muscle actin organization [J]. Mol Biol Cell, 2005,16(9):4214-4224.

[10] Yan XH, Liu ZY, Chen YG. Regulation of TGF-β signaling by Smad7[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2009,41(4):263-272.

[11] 楊 斌,曾維政,吳曉玲. HSCs表型轉(zhuǎn)化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其阻斷劑的研究進展[J].世界華人消化雜志,2009,17(22):2283-2291.

[12] 呂沐瀚，李曉云，李昌平.轉(zhuǎn)化生長因子β1對肝星狀細胞活化及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響與舒肝顆粒的干預(yù)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(50): 9898-9902.

[13] 紀(jì) 輝,遲寶榮,張一寧.肝纖維化與肝星狀細胞[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008,34(3):538-542.

[14] 俞蕾敏，呂 賓.TGF-β/smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肝纖維化的關(guān)系[J].國際消化病雜志, 2008,28(5): 397-400.

[15] 哈明昊,饒慧英,劉 峰,等．乙型肝炎病毒促進CTGF和TGF-β1在肝星狀細胞中的表達[J]．世界華人消化雜志，2008，16(9)：924-928．

RoleofhepatitisBvirusinintrahepaticTGF-β1/Smadssignalingpathway

ZHANG Xiang-mei1, LE Xiao-hua1, CHEN Pei-fen1, GOU Ji-zhou1, SUN Yan1, ZHONG Xun-zhen1,ZHOU Ya-min2, LIU Xiao-ling2, CHEN Qing-shan2

(1DepartmentofPathology,theThirdPeople’sHospitalofShenzhen,Shenzhen518112,China;2EpidemiologyDivision,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tchqsh@jnu.edu.cn)

AIM: To explore the effects of hepatitis B virus (HBV) on intrahepatic expression of transforming growth factor β1(TGF-β1) and Smads.METHODSThe expression of intrahepatic TGF-β1, HBsAg and HBcAg in control group and chronic hepatitis B (CHB) group was detected by immunohistochemical method.The serum HBV DNA content was determined by real-time PCR. The role of HBV in the expression of TGF-β1, Smad3 and Smad7 in human hepatic stellate cell line LX-2invitrowas observed by cell culture and Western blotting.RESULTSThe average score of intrahepatic TGF-β1expression in CHB group was higher than that in control group. With the increase in serum HBV DNA content, intrahepatic TGF-β1expression was also enhanced. In the HBcAg positive hepatic tissue, there was higher TGF-β1expression than that in the liver tissue of HBcAg negative. Compared with control group and HBV+anti-TGF-β1group, HBV caused increased expression of TGF-β1and Smad3 in HBV groupinvitro. No difference of Smad7 protein among control group, HBV group and HBV+anti-TGF-β1group was observed.CONCLUSIONThe expression of intrahepatic TGF-β1is related to serum HBV DNA and hepatocellular HBcAg in the patients with CHB. HBV-induced liver fibrosis mainly relies on positive regulatory mechanisms of Smad3,and the negative regulation by Smad7 almost does not function.

Hepatitis B virus; Transforming growth factor β1; Smad proteins; Liver fibrosis

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.12.016

1000- 4718(2013)12- 2218- 05

2013- 09- 09

2013- 10- 31

深圳市科技計劃(醫(yī)療衛(wèi)生類)(No.20103133；No. 201202060)

△通訊作者 Tel: 020-85220258； E-mail: tchqsh@jnu.edu.cn