間歇性低壓缺氧預處理對大鼠全腦缺血/再灌注海馬CA1區Ngb和Bcl-2蛋白表達的影響*

劉永年， 俞科賢， 馬祁生， 吳 穹

(青海大學醫學院病理生理教研室，青海 西寧 810001)

間歇性低壓缺氧預處理對大鼠全腦缺血/再灌注海馬CA1區Ngb和Bcl-2蛋白表達的影響*

劉永年， 俞科賢， 馬祁生， 吳 穹△

(青海大學醫學院病理生理教研室，青海 西寧 810001)

目的探討間歇性低壓缺氧預處理對大鼠全腦缺血/再灌注海馬CA1區腦紅蛋白(Ngb)和Bcl-2蛋白表達的影響。方法將Wistar大鼠隨機分為假手術組、低壓缺氧預處理對照組、全腦缺血/再灌注組、低壓缺氧預處理+全腦缺血/再灌注組4組，將間歇暴露于低壓缺氧環境的大鼠作為低壓缺氧預處理對照組。采用Pulsinelli四血管閉塞法復制大鼠全腦缺血/再灌注模型，夾閉頸總動脈造成全腦缺血8 min后再灌注。用硫堇染色法和免疫組織化學方法分別觀察大鼠海馬組織學改變和海馬組織Ngb、Bcl-2蛋白表達變化。結果低壓缺氧預處理+全腦缺血/再灌注組大鼠海馬CA1區存活細胞數較全腦缺血/再灌注組明顯增加，其海馬組織Ngb和Bcl-2蛋白表達量較全腦缺血/再灌注組顯著升高。結論間歇性低壓缺氧預處理可能通過上調海馬組織Ngb和Bcl-2蛋白的表達，減少全腦缺血再灌注后海馬神經元的死亡而發揮神經保護作用。

腦缺血； 再灌注損傷； 間歇性低壓缺氧； 腦紅蛋白; Bcl-2蛋白

前期實驗表明[1]，間歇性低壓缺氧預處理(intermittent hypobaric hypoxia preconditioning，IHHP)可誘導大鼠海馬神經元產生晚期預適應，減輕缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后腦損傷程度。然而，IHHP對神經元的保護機制尚不清楚。神經元晚期預適應的形成有其共同規律，首先需要一個適度的預處理過程，后需要間隔約1～2 d的潛伏期，神經保護作用可持續數天，此現象提示，神經元晚期預適應可能通過基因表達的變化及新的蛋白質合成來實現[2-3]。本研究采用免疫組織化學方法，觀察IHHP對大鼠全腦缺血/再灌注海馬組織腦紅蛋白(neuroglobin，Ngb)和B細胞白血病/淋巴瘤2(B-cell leukemia/lymphoma-2，Bcl-2)蛋白表達的影響，以探討IHHP可能的保護機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 健康雄性Wistar大鼠48只，體重280～300g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。

1.2主要儀器和試劑 Olympus光學顯微鏡，Motic6.0數碼醫學圖像分析系統，SP9001試劑盒(北京中杉生物工程公司)，硫堇(thionine;Sigma)，兔抗鼠Ngb多克隆抗體(中國軍事醫學科學院)，兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體(武漢博士德生物技術有限公司)。

2方法

2.1動物分組 隨機將48只大鼠分為4組，每組12只(用于硫堇染色和免疫組化各6只)。(1)假手術(sham)組：僅凝閉雙側椎動脈，凝閉2 d后暴露兩側頸總動脈但不夾閉；(2)IHHP組:暴露于低壓缺氧環境4 d后，凝閉雙側椎動脈，每天1次，連續4 d，第5天凝閉雙側椎動脈，2 d后暴露兩側頸總動脈但不夾閉；(3)I/R組：凝閉雙側椎動脈，2 d后暴露并夾閉雙側頸總動脈8 min后恢復血液再灌注；(4)IHHP+I/R組：低壓缺氧4 d，每天1次，第5天凝閉雙側椎動脈，2 d后暴露兩側頸總動脈并夾閉8 min，而后恢復血液再灌注。12只大鼠中6只于再灌注后7 d處死，取海馬，硫堇染色觀察海馬CA1區組織存活神經元數目，余6只于再灌注后1 d取材，采用免疫組織化學方法觀察海馬CA1區Ngb及Bcl-2蛋白的表達。

2.2IHHP動物模型及大鼠全腦缺血模型的建立 優化呂國蔚等[4]急性重復缺氧模型法而建立IHHP動物模型[1]，采用Pulsinelli等[5]大鼠四血管閉塞法制作大鼠全腦缺血模型。

2.3硫堇染色及存活神經元密度計數 每組半數大鼠行再灌注7 d后，大鼠麻醉完全后斷頭取腦，冠狀面切取位于視交叉后1～4 mm處的腦組織，將所取標本置于4%多聚甲醛固定液48 h后，常規包埋、切片(5 μm厚)，行硫堇染色，然后鏡下計數存活神經元密度(neuronal density, ND)。

2.4Ngb和Bcl-2免疫組織化學染色及半定量分析 再灌注1 d后，大鼠完全麻醉后斷頭取腦，固定、包埋、切片同硫堇染色，按試劑盒說明行免疫組織化學染色。陰性對照用0.01 mol/L PBS代替Ngb抗體及

Bcl-2抗體。鏡下觀察，應用圖像分析系統測量陽性染色面積和平均吸光度。

3統計學處理

應用SPSS 13.0軟件處理。數據以均數±標準差即(mean±SD) 表示，組間比較采用One-way ANOVA分析，有顯著差異者的兩兩比較采用最小顯著差異法，P<0.05 時認為差異有統計學意義。

結 果

1IHHP對大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區存活神經元密度的影響

Sham組存活神經元密度高(圖1A、表1)；IHHP組大鼠海馬CA1區組織形態與sham組比較變化不明顯，神經元密度與sham組相比無顯著差異(P>0.05；圖1B、表1)；I/R組大鼠海馬CA1區錐體細胞明顯缺失，與sham組相比，存活神經元密度值明顯降低(P<0.01；圖1C、表1)；IHHP+I/R組海馬CA1區錐體細胞排列情況和細胞形態均較I/R組明顯改善，存活神經元密度明顯升高(P<0.01；圖1D、表1)。

Figure 1. Thionine staining of hippocampal CA1 region in each group (×400). A: sham; B: IHHP； C: I/R； D: IHHP+I/R.

圖1各組海馬CA1區硫堇染色

表1各組海馬CA1區存活神經元密度計數

Table 1. The neuronal density of hippocampal CA1 region in each group(mm-2.Mean±SD.n=6)

GroupNeuronaldensitySham149.3±2.5IHHP141.0±12.8I/R41.7±3.8*△IHHP+I/R119.5±14.0*△▲

*P<0.05vssham group；△P<0.05vsIHHP group；▲P<0.05vsI/R group.

2IHHP對大鼠全腦I/R后海馬CA1區Ngb蛋白表達影響

鏡下sham組大鼠海馬CA1區可見少量Ngb棕黃色陽性細胞；IHHP 組與sham組相比，Ngb免疫反應陽性細胞面積增大(P<0.01)，且陽性細胞平均吸光度值也相應增大(P<0.01)；I/R組錐體細胞層Ngb陽性細胞數目較少，染色較淺，與sham組相比顯著降低(P<0.01)，與sham組相比，陽性細胞平均吸光度值也顯著降低(P<0.05)；IHHP+I/R組大鼠海馬Ngb免疫反應陽性細胞面積和陽性細胞平均吸光度與單純I/R組相比，均顯著升高(P<0.01)，但較IHHP 組明顯降低(P<0.01),見圖2～4。

Figure 2. Effect of IHHP on the Ngb expression in hippocampus CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion (immunohistochemical staining,×400). A: sham group; B: IHHP group; C: I/R group; D: IHHP+I/R group.

圖2免疫組化檢測各組海馬CA1區Ngb表達

Figure 3. Effect of IHHP on the total area of Ngb positive cells in hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsIHHP group.

圖3各組海馬CA1區Ngb陽性細胞染色面積

Figure 4. Effect of IHHP on the average absorbance of Ngb positive cells in the hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion. Mean±SD.n=6.*P<0.05，**P<0.01vssham group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsIHHP group.

圖4各組海馬CA1區Ngb陽性細胞平均吸光度

3IHHP對大鼠全腦I/R后海馬CA1區Bcl-2蛋白表達影響

鏡下觀察結果顯示，與sham組相比，IHHP 組Bcl-2陽性細胞染色面積及陽性細胞平均吸光度值都明顯增加(P<0.01)；同樣，I/R組Bcl-2陽性細胞染色面積和陽性細胞平均吸光度值均明顯增加(P<0.01)；IHHP+I/R組與單純I/R組比較，Bcl-2陽性細胞平均吸光度和陽性染色面積均顯著升高(P<0.01)，且明顯高于IHHP組水平(P<0.01)，見圖5～7。

Figure 5. Effect of IHHP on the Bcl-2 protein exprssion in hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion by immunohistochemistry me-thod (×400). A: sham group; B: IHHP group; C: I/R group; D: IHHP+I/R group.

圖5免疫組化檢測各組海馬CA1區Bcl-2表達

Figure 6. Effect of IHHP on the total area of Bcl-2 positive cells in hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsIHHP group.

圖6各組海馬CA1區Bcl-2陽性細胞染色面積

Figure 7. Effect of IHHP on the average absorbance of Bcl-2 positive cells in the hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia/reperfusion.Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsIHHP group.

圖7各組海馬CA1區Bcl-2陽性細胞平均吸光度水平

討 論

腦紅蛋白是Burmester等[6]發現的第3類攜氧球蛋白，可增強氧氣進入線粒體的能力，提高氧利用率，從而滿足神經細胞活躍的氧代謝需求，體內外實驗均證實，缺氧環境可引起腦紅蛋白表達上調[7]，腦內Ngb的表達增加對神經元有明顯的保護作用；本實驗中IHHP組較sham組海馬CA1區Ngb陽性細胞面積和平均吸光度值均顯著升高，IHHP+I/R組較I/R組Ngb表達也顯著升高，說明間歇性低壓缺氧亦可增加Ngb的表達，與陳秀蓮等[8]報道的“缺血再灌注小鼠Ngb mRNA 和蛋白質表達水平在短時間內( 6～48 h) 均升高，提示Ngb對腦組織可能起應激性保護作用”觀點一致。張盈等[9]研究提示，蕨麻乙醇提取物可能通過促進Ngb 表達，增強神經元對缺氧的耐受能力，減輕神經元損傷，對神經元起到保護作用。這也從另一個層面反映了Ngb對神經元保護的積極作用。

Burmester等[6]的研究表明，Ngb在不同腦區的分布程度與腦區對缺氧的耐受程度密切相關。本實驗中I/R組大鼠海馬CA1區Ngb表達較sham組下降，甚至出現成片的表達缺失區域，可能源于缺血缺氧造成腦組織損傷使神經元缺失；而IHHP組和IHHP+I/R組大鼠海馬CA1區Ngb表達增加，表明低壓缺氧可上調海馬CA1區Ngb的表達水平，提示Ngb對腦缺血性損傷的重要保護作用，Ngb表達水平很可能是不同腦區對腦缺血性損傷耐受性差異的因素之一。有研究表明， Ngb的含量越低, 神經組織對缺氧的耐受性也越差[10]，提示Ngb在腦缺氧的適應性保護過程中起重要作用， 同時從另一個側面說明Ngb 可能增加神經細胞的氧供應，提高神經細胞的存活和功能。Ngb作為神經系統中特異的攜氧球蛋白,與腦內氧供應密切相關，研究攜氧載體在神經膠質細胞中的表達對認識和治療腦缺氧性疾病及神經變性疾病(如老年癡呆) 的分子機理有十分重要的意義,使我們有可能在缺氧的極早期就利用此攜氧載體干預缺氧的發生和發展，使從根本上防治腦缺氧成為可能[11]。

Bcl-2蛋白是一種內源性抗凋亡因子，神經元過表達Bcl-2可通過維持線粒體的完整性來抑制缺血再灌注損傷引起的神經元凋亡[12-13]。正常腦組織 Bcl-2 蛋白含量極低，用普通的免疫組織化學方法幾乎測不出[14]。本實驗顯示，sham組有散在的、微弱的Bcl-2表達，可能是手術創傷刺激引起；實驗中I/R組Bcl-2表達較sham組升高，推測腦I/R后Bcl-2 可在缺血早期尚存活的細胞中較高表達，從而抑制細胞凋亡，IHHP 組與sham組相比，Bcl-2陽性細胞染色面積增大，IHHP+I/R組與單純I/R組比較， Bcl-2表達亦顯著升高，說明IHHP可通過上調海馬CAl區Bcl-2表達來減輕腦缺血后神經元凋亡。

李淑琴[15]研究發現，肢體缺血預處理上調海馬CAl區Ngb表達后，Bcl-2 mRNA表達顯著增加，而于肢體缺血預處理前在大鼠側腦室注射Ngb 反義寡核苷酸下調Ngb表達后，Bcl-2 mRNA表達明顯下降；另外，有離體實驗研究發現，PC12細胞利用NO供體硝普鈉過表達Ngb，可明顯減輕SNP誘導的PC12細胞損傷，隨后對其機制的研究發現，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達在Ngb過表達后明顯上升[16]；由此我們推測，IHHP使Ngb表達上調，其抗損傷的機制之一可能是作用于細胞凋亡通路中的線粒體途徑，使Bcl-2表達增強，從而減少腦缺血后神經元凋亡，畢竟Bcl-2 抗細胞凋亡的能力是有限的，在腦缺血細胞凋亡的過程中，Bcl-2不可能是促凋亡和抗凋亡的唯一因素，應該還有其它凋亡調控基因共同參與其中，各種凋亡基因的調控變化及其相互關系尚待進一步研究。

[1] 吳 穹,齊 杰,劉偉力,等.間歇性低壓缺氧預處理對大鼠全腦缺血/再注后海馬神經元的保護作用[J].青海醫學院學報,2012,33(1):16-22.

[2] Brown JE,Zeiger SL,Hettinger JC,et al.Essential role of the redox-sensitive kinase p66shcin determining energetic and oxidative status and cell fate in neuronal preconditio-ning[J].J Neurosci,2010,30(15):5242-5252.

[3] Racay P,Chomova M,Tatarkova Z,et al.Ischemia induced mitochondrial apoptosis is significantly attenuated by ischemic preconditioning[J].Cell Mol Neurobiol,2009,29(6-7):901-908.

[4] 呂國蔚,史美棠,李 凌,等.急性重復缺氧對小鼠缺氧耐受性的影響及其機制的初步探討[J].中國病理生理雜志,1992,8(4):425-429.

[5] Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J].Stroke,1979,10(3):267-272.

[6] Burmester T,Weich B,Reinhardt S, et al. A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407(6803):520-523.

[7] Jin K,Mao Y,Mao X,et al.Neuroglobin expression in ischemic stroke[J].Stroke,2010,41(3):557-559.

[8] 陳秀蓮,陳 瑞,高春錦,等.短暫前腦缺血小鼠海馬腦紅蛋白表達的動態變化[J].動物學雜志,2008, 43(1): 147-152.

[9] 張 盈，李靈芝，楊 虎，等.蕨麻對低壓缺氧大鼠腦組織腦紅蛋白表達的影響[J].天津中醫藥，2013，30(4)：224-227.

[10] Reuss S, Saaler-Reinhardt S, Weich B, et al. Expression analysis of neuroglobin mRNA in rodent tissues[J] . Neuroscience, 2002, 115(3): 645-656.

[11] 尹時華,龔樹生, 鄢開勝,等.重組小鼠質粒pEGFP- NGB 的構建和在培養神經膠質細胞中表達的實驗研究[J].中國病理生理雜志,2005, 21(7):1388-1392.

[12] Zhang H,Li Q, Li Z,et al .The protection of Bcl-2 overexpression on rat cortical neuronal injury caused by analogous ischemia/reperfusioninvitro[J].Neurosci Res,2008,62(2):140-146.

[13] Xing B,Chen H,Zhang M,et al.Ischemic preconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat[J].Stroke,2008,39(8) :2362-2369.

[14] Hong KW,Kim KY,Lee JH, et al. Neuroprotective effect of (2S,3S,4R)-N″-cyano-N-(6-mino-3,4-dihydro-3-hydroxy-2-methyl-2-dimethoxymethyl-2H-benzopyran-4-yl)-N′-benzylguanidine (KR-313-78), a benzopyran analog, against focal ischemia brain damage in rats[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2002,301(1):210-216.

[15] 李淑琴.腦紅蛋白在肢體缺血預處理腦保護中的作用及其機制[D].石家莊:河北醫科大學,2009.

[16] 陳婷方.腦紅蛋白神經保護功能及其機制的初步研究[D].北京：中國人民解放軍軍事醫學科學院,2008.

EffectofintermittenthypobarichypoxiapreconditioningonexpressionofNgbandBcl-2inhippocampalCA1regioninratswithglobalcerebralischemia-reperfusion

LIU Yong-nian, YU Ke-xian, MA Qi-sheng, WU Qiong

(DepartmentofPathophysiology,MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail: 13997126828@163.com)

AIM: To study the effect of intermittent hypobaric hypoxia preconditioning (IHHP) on the expression of neuroglobin (Ngb) and Bcl-2 in hippocampal CA1 region in the rats with global cerebral ischemia-reperfusion.METHODSThe Wistar rats were randomly divided into sham group, IHHP control group, global cerebral ischemia-reperfusion group (I/R group), and IHHP+I/R group. The 4-vessel occlusion rat model of Pulsinelli was performed in the rats in I/R group and IHHP+I/R group, in which the common carotid artery was occluded for 8 min before reperfusion. Thionine staining and immunohistochemical staining were used to observe the histological changes of the hippcampus and the expression of Ngb and Bcl-2 in the hippocampal CA1 region.RESULTSA significant increase in the quantity of surviving cells in the hippocampal CA1 region was observed in IHHP+I/R group as compared with I/R group. There was a significant increase in the expression of Ngb and Bcl-2 in the hippocampal CA1 region in IHHP+I/R group as compared with I/R group.CONCLUSIONThrough the up-regulation of hippocampal Ngb and Bcl-2 expression, intermittent hypobaric hypoxia preconditioning may play a role in neuroprotection by reducing hippocampal neuronal apoptosis from ischemia-reperfusion.

Brain ischemia; Reperfusion injury; Intermittent hypobaric hypoxia; Neuroglobin; Bcl-2 protein

R364.4；Q786

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.12.020

1000- 4718(2013)12- 2240- 05

2013- 05- 10

2013- 10- 25

教育部“春暉計劃”合作科研項目(No.Z2012079)；青海大學醫學院科學技術研究項目(No.QY-2008-08)

△通訊作者Tel: 0971-6104095; E-mail: 13997126828@163.com