抗環瓜氨酸肽抗體與類風濕關節炎患者成纖維樣滑膜細胞遷移和侵襲能力的相關研究*

劉志昌， 肖游君， 勞敏曦， 黃明城， 曾 珊， 許韓師， 楊岫巖， 梁柳琴

(中山大學附屬第一醫院風濕免疫內科，廣東 廣州 510080)

抗環瓜氨酸肽抗體與類風濕關節炎患者成纖維樣滑膜細胞遷移和侵襲能力的相關研究*

劉志昌#， 肖游君， 勞敏曦， 黃明城， 曾 珊， 許韓師， 楊岫巖， 梁柳琴△

(中山大學附屬第一醫院風濕免疫內科，廣東 廣州 510080)

目的研究抗環瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體與類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)患者成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte, FLS)遷移和侵襲的關系。方法FLS分離自22例活動性RA患者、12例骨關節炎(OA)和6例無關節炎病史的外傷患者滑膜組織；FLS遷移和侵襲能力采用Transwell小室測定。結果RA組、OA組和正常組FLS遷移數目分別為(29.33±10.93)、(9.28±7.87)和(7.00±4.07)個/視野，侵襲細胞數分別為(14.35±7.67)、(3.96±4.37)和(3.08±1.03)個/視野，RA組與其它2組的遷移細胞數和侵襲細胞數比較均有顯著差異；抗CCP抗體陽性RA患者FLS與抗CCP陰性RA患者FLS相比，前者遷移和侵襲能力均強于后者；相關性分析亦發現，抗CCP抗體陽性及抗CCP抗體滴度與RA患者FLS的侵襲和遷移能力密切相關。結論抗CCP抗體陽性的RA患者FLS的遷移和侵襲能力更強，抗CCP抗體可能與RA患者FLS的遷移和侵襲能力改變有關。

關節炎，類風濕； 抗環瓜氨酸肽抗體； 成纖維樣滑膜細胞； 細胞遷移

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種系統性自身免疫性疾病，以不可逆的骨關節破壞為主要特征。目前認為抗環瓜氨酸肽 (anti-cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體對RA關節侵蝕性損害具有較高的預測價值，但抗CCP抗體引起關節侵蝕性病變的機制不清楚。

RA成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)對關節的侵蝕破壞起了重要的作用[1-2]，但不同病人之間FLS遷移和侵襲性不一，其中的原因不十分清楚。近年研究發現，不同病人來源的FLS的遷移和侵襲性比病人自身體內不同關節來源的FLS的遷移和侵襲性差異更為顯著，因而認為FLS的遷移和侵襲性具有明顯的個體差異。且有研究報道FLS侵襲性強的RA患者與FLS侵襲性弱的患者相比，前者更易發展為影像學能檢測到的骨關節破壞，且Sharp評分往往更高[3-4]。這些研究提示RA患者FLS侵襲性的強弱與RA關節破壞密切相關，但抗CCP抗體是否與RA患者FLS的侵襲性有關目前尚無報道。所以本研究將探討RA患者中抗CCP抗體與FLS的遷移和侵襲特性的關系，以期進一步闡明RA關節破壞的發生機制。

材 料 和 方 法

1對象

滑膜標本來自于2008年至2012年就診于中山大學附屬第一醫院的患者，其中RA患者22例(女性17例，男性5例)，病程(10±9)年，均符合美國風濕病學會1987年類風濕關節炎診斷標準，處于疾病活動期(DAS28≥2.6)，均使用過小劑量糖皮質激素(強的松，≤10 mg/d)、非甾體抗炎藥、緩解病情抗風濕藥，但均未接受過抗腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)抗體等生物制劑治療。另設12例骨關節炎患者(女性8例，男性4例)和6例無關節炎病史的外傷(女性2例，男性4例)為對照組。

2滑膜細胞的分離和培養

滑膜組織取自行關節鏡和關節置換的患者。術中取出的滑膜組織于無菌條件剪碎,加入1 g/L I型膠原酶(Gibco)，充分混勻后將其置于37℃、5%CO2的細胞培養箱孵育4～6 h。用孔直徑約為10 μm的細胞篩網過濾碎屑；常溫下離心收集細胞，加入含20%FBS的DMEM/F12培養基(Gibco)進行培養。約24 h后成纖維樣滑膜細胞黏附于培養瓶壁上，此時換成含10% 胎牛血清(Gibco)的DMEM/F12培養基培養。通過形態學和免疫組化檢測成纖維樣滑膜細胞標志物(如CD106，CD55),鑒定本實驗所用細胞是成纖維樣滑膜細胞。用第3～5代的細胞進行實驗。

3體外遷移實驗

體外遷移實驗中，用無血清培養基平衡8 μm的Boyden小室(Corning)12～24 h；準備好細胞懸液，計數板計數后，在上室中準確加入6.0×107/L的細胞懸液200 μL，下室加入含10%胎牛血清的培養基600 μL后，置培養箱中遷移12 h。將上室取出，磷酸鹽緩沖液(Gibco)清洗3遍，加入純甲醇(Sigma)200 μL固定細胞10～15 min，結晶紫(Sigma)染色10～15 min。將結晶紫吸出，用棉簽輕輕擦拭膜內面，將Transwell板上膜切下，并用中性樹膠封片于載玻片。高倍鏡下(×100)，每張膜隨機選取8個視野計數，取其平均值。每個標本重復3次。

4體外侵襲實驗

體外侵襲實驗中的Boyden小室(BD)膜上已鋪好Matrigel膠，實驗前用無血清培養基平衡8 μm的Boyden小室12～24 h；準備好細胞懸液，計數板計數后，在上室中準確加入6.0×107/L的細胞懸液400 μL，下室加入含15%胎牛血清的培養基750 μL后，置培養箱中遷移48 h。將上室取出，磷酸緩沖液(Gibco)清洗3遍，加入純甲醇(Sigma)200 μL固定細胞10～15 min，結晶紫(Sigma)染色10～15 min。將結晶紫吸出，用棉簽輕輕擦拭膜內面，將Transwell板上膜切下，并用中性樹膠封片于載玻片。高倍鏡下(×100)，每張膜隨機選取8個視野計數，取其平均值。每個標本重復3次。

5抗CCP抗體、類風濕因子(rheumatoidfactor,RF)、C反應蛋白(C-reactiveprotein,CRP)和紅細胞沉降率(erythrocytesedimentationrate,ESR)的檢測

(1)標本：清晨空腹采靜脈血3 mL，血沉管2 mL，抗CCP抗體、RF、CRP和ESR的檢測均在2 h內完成。(2)檢測：采用化學發光微粒子免疫分析法(chemiluminescence microparticle immunoassay)對抗CCP抗體進行檢測，試劑由美國雅培公司提供，線性檢測閾值為0.5～200 RU/mL，分別用<0.5 RU/mL和>200 RU/mL來表示檢驗閾值以外的數據；采用散射比濁法對IgM-RF進行檢測，試劑由德國西門子公司提供，檢測閾值>9.19 IU/mL，檢驗閾值以外的數據用<9.19 IU/mL來表示；ESR采用魏氏檢測法，CRP采用散射比濁法進行檢測, 以上試劑均由杭州歐蒙公司提供。

6統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析。正態分布數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用One-way ANOVA, 兩兩比較采用LSD-t檢驗；以中位數描述非正態分布資料，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關性分析采用Spearman法分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1病人基本資料

22例RA患者，女性患者17例，男性5例，平均年齡(55.10±8.75)歲；OA組共12例，女性患者8例，男性4例，平均年齡(64.33±7.57)歲；正常人標本共6例，男性4例，女性2例，平均年齡(65.00±8.05)歲,基本資料見表1。

表1 患者的基本資料

RA: rheumatoid arthritis; OA: osteoarthritis.

2RA患者、OA患者和正常人FLS遷移能力的比較

22例RA組患者平均遷移細胞數為(29.33±10.93)個/視野。12例OA組患者平均遷移細胞數(9.28±7.87)個/視野。6例正常人平均遷移細胞數(7.00±4.07)個/視野。RA患者FLS遷移細胞數與OA患者和正常人比較差異有統計學意義(P<0.01)，但OA患者FLS與正常人FLS的遷移細胞數差別無統計學意義,見圖1。

3RA患者、OA患者和正常人FLS侵襲能力的比較

22例RA組患者平均侵襲細胞數(14.35±7.67)個/視野。12例OA組患者平均侵襲細胞數(3.96±4.37)個/視野。6例正常人平均侵襲細胞數(3.08±1.03)個/視野。RA患者FLS侵襲細胞數與OA患者和正常人比較差異有統計學意義(P<0.01)，但OA患者FLS與正常人FLS的侵襲細胞數差別無統計學意義，見圖2。

Figure 1. Migration of FLS from normal control and patients with RA and OA(crystal violet staining,×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vsRA.

圖1RA、OA和正常人FLS遷移能力檢測

Figure 2. Invasion of FLS from normal control and patients with RA and OA(crystal violet staining,×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vsRA.

圖2RA、OA和正常人FLS侵襲能力檢測

4RA患者抗CCP抗體與FLS遷移能力的相關性

RA 患者抗CCP抗體陽性為16例，遷移細胞數為(35.80±9.03)個/視野，抗CCP抗體陰性患者為6例，遷移細胞數為(16.08±13.42)個/視野,兩者差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. Migration of FLS from anti-CCP antibody-positive and anti-CCP antibody-negative patients with RA (crystal violet staining,×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vsanti-CCP antibody (+).

圖3抗CCP抗體陽性和陰性RA患者FLS遷移情況

5RA患者抗CCP抗體與FLS侵襲能力的相關性

RA 患者抗CCP抗體陽性為16例，侵襲細胞數為(18.22±4.03)個/視野；抗CCP抗體陰性患者為6例，侵襲細胞數為(3.76±1.04)個/視野，兩者差異有統計學意義(P<0.01),見圖4。

Figure 4. Invasion of FLS from anti-CCP antibody-positive and anti-CCP antibody-negative patients with RA (crystal violet staining,×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vsanti-CCP antibody (+).

圖4抗CCP抗體陽性和陰性RA患者FLS侵襲情況

6RA患者FLS的遷移能力和侵襲能力與有關臨床指標的相關性分析

對臨床指標與RA患者FLS遷移和侵襲的相關性進行分析，結果表明抗CCP抗體陽性、抗CCP抗體滴度、DAS28、Sharp評分與FLS的遷移和侵襲相關，且均有統計學意義，見表2、3。

表2臨床指標與RA患者FLS遷移能力的相關性分析

Table 2. Correlation between clinical indexes and the migration of FLS from RA patients

DescriptionrPAnti-CCPpositivepercentage0.772<0.01Anti-CCPantibodytiter0.656<0.01IgM-RFpositivepercentage0.171>0.05IgM-RFtiter0.227>0.05CRP0.281>0.05ESR0.542<0.01DAS280.620<0.01Sharpscore0.562<0.01

表3臨床指標與RA患者FLS侵襲能力的相關性分析

Table 3. Correlation between clinical indexes and the invasion of FLS from RA patients

DescriptionrPAnti-CCPpositivepercentage0.740<0.01Anti-CCPantibodytiter0.458<0.05IgM-RFpositivepercentage0.197>0.05IgM-RFtiter0.089>0.05CRP0.373>0.05ESR0.349>0.05DAS280.425<0.05Sharpscore0.455<0.05

討 論

RA的主要病理特征是滑膜增生、炎癥細胞浸潤、血管翳形成和軟骨及骨組織侵蝕性破壞。滑膜細胞增殖、活化和變得具有侵襲性是RA關節炎癥和破壞持續進展的關鍵環節[1]。最近的研究表明，RA患者的FLS不僅能在關節腔內發生短距離的遷移、侵襲和降解關節軟骨，而且還可以發生跨血管內皮的長距離遷移和侵襲[5],提示RA患者FLS的遷移和侵襲能力異常在RA關節破壞中扮演重要角色。

在正常滑膜組織中，瓜氨酸化蛋白表達量低，其表位抗原參與了滑膜組織中血管外纖維蛋白的沉積，以及血管外纖維蛋白原的聚集過程。但瓜氨酸化蛋白在自身免疫性疾病中廣泛存在，表明瓜氨酸化修飾及修飾后產生的抗瓜氨酸化蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibodies,ACPA)在自身免疫性疾病發病中起了重要的作用。新近發現的ACPA包括抗瓜氨酸化纖維蛋白原抗體、抗突變型瓜氨酸化波形蛋白和抗CCP抗體，其中抗CCP抗體是2000年首次以聚絲蛋白cDNA序列人工合成的含瓜氨酸的環肽，其對RA的診斷特異性和敏感性均較好，從而被視為RA的血清標志物并用于臨床上檢測，作為判斷RA預后的危險因素，與基因標志物相比，具有更好的預后價值[6]。Combe等[7]研究發現，抗CCP抗體和ESR是早期RA患者關節影像學破壞的最重要的預測因素。Kroot等[8]的研究也發現抗CCP抗體陽性的患者比抗CCP抗體陰性的患者關節有更明顯的影像學上改變和破壞。目前大部分研究支持抗CCP抗體具有預測關節影像學上改變和破壞的能力。抗CCP抗體在一些RA患者癥狀出現前就已經出現，與CCP抗體陰性患者相比，往往有著更多以及更為嚴重的關節侵蝕。抗CCP抗體出現先于癥狀數年，表明與抗CCP抗體陽性相關的亞臨床過程已經開始，因而關節侵蝕可以在沒有任何明顯臨床炎癥反應下發生。但是抗CCP抗體是如何引起關節破壞的，目前尚不清楚。

關節軟骨被侵襲是RA關節破壞的特點之一，臨床上RA患者的滑膜炎與進展性關節破壞往往并存，因而認為持續存在的炎癥是導致RA 關節破壞的“罪魁禍首”，但近年亦有研究發現，滑膜炎與骨侵蝕、關節破壞之間聯系并不十分緊密，部分患者甚至出現背離的情況。最近研究發現發生穩定激活改變的RA患者FLS出現的“類腫瘤樣改變”如抗凋亡、產生炎癥因子以及遷移和侵襲特性等，在軟骨和骨破壞中起了重要作用。RA患者FLS侵蝕關節軟骨的能力及向遠處遷移的功能，可能源于其生物學行為的內在改變。有研究[3]收集了72名RA患者FLS以及50名OA患者FLS，并檢測其遷移侵襲能力，結果提示FLS的侵襲性與組織的侵襲破壞相關。同時相關性分析發現細胞的遷移侵襲能力與關節影像學破壞的程度相關，FLS侵襲能力低的患者Sharp評分為4.0/年，而FLS侵襲能力強的患者Sharp評分為21.8/年。與OA患者FLS相比，RA患者FLS遷移和侵襲能力較強。抗CCP抗體以及FLS的侵襲能力皆可能是RA關節破壞的原因，同時均能預測患者關節影像學破壞程度，這兩者之間是否存在相關性目前仍不甚清楚。

本研究結果發現，RA患者FLS 與OA患者FLS、正常人FLS相比，前者比后二者遷移和侵襲能力增強，差異有統計學意義，這與以往的報道結果一致。如Muller-Ladner等[9]研究發現將人FLS與軟骨共植于SCID鼠，RA患者的FLS能夠黏附并侵襲到軟骨，而OA患者以及正常人來源的FLS則侵襲能力差。

本研究進一步研究發現，抗CCP抗體陽性RA患者FLS與抗CCP陰性RA患者 FLS相比，前者遷移和侵襲能力均強于后者。通過相關性分析亦發現，抗CCP抗體陽性及抗CCP抗體滴度與RA成纖維樣滑膜細胞侵襲和遷移能力密切相關，提示抗CCP抗體陽性患者FLS遷移和侵襲能力較強，可能更容易發生關節破壞。最近研究發現[10]，破骨細胞可以表達一種可以被抗瓜氨酸波形蛋白抗體(ACPA的主要類型之一)識別的表位，培養基中的ACPA可以促進破骨細胞生成，引起骨吸收陷凹的數目(即體外實驗中骨損害的指標)上升。上述發現佐證了臨床上觀察到的ACPA與RA關節侵襲性病變之間的關聯，提示ACPA可能直接參與RA的關節破壞。而本研究首次從另一個新的角度，即抗CCP抗體與RA滑膜細胞侵襲性之間的關系，初步探討了抗CCP抗體陽性與RA侵襲性病變類型之間的可能聯系機制，提示CCP可能通過某種新的機制直接或間接地影響RA患者 FLS的侵襲性，這對進一步認識RA關節破壞的機制具有重要意義。

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Relationshipbetweenanti-CCPantibodyandmigrationorinvasionabilityoffibroblast-likesynoviocytesfromrheumatoidarthritispatients

LIU Zhi-chang, XIAO You-jun, LAO Min-xi, HUANG Ming-cheng, ZENG Shan, XU Han-shi, YANG Xiu-yan, LIANG Liu-qin

(DepartmentofRheumatologyandClinicalImmunology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:lliuq@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate the relationship between anti-cyclic citrullinated peptide (anti-CCP) antibody and migration or invasion ability of fibroblast-like synoviocytes (FLS) from rheumatoid arthritis (RA) patients.METHODSFLS was isolated from 22 patients with active RA, 12 patients with osteoarthritis (OA) and 6 patients with joint injuries without arthritis history. The migration and invasion abilities were assessed by Transwell assay.RESULTSAmong the patients of RA, OA and normal controls, the numbers of migratory cells were (29.33±10.93), (9.28±7.87) and (7.00±4.07)/field, respectively, and the numbers of invasive cells were (14.35±7.67), (3.96±4.37) and (3.08±1.03)/field, respectively. The numbers of migratory and invasive cells were higher in RA than those in the other groups. The migration and invasion abilities of RA FLS from anti-CCP antibody-positive RA patients were significantly increased as compared with anti-CCP antibody-negative RA patients. Correlation analysis revealed that the migration and invasion abilities of RA FLS were correlated with the positive and high titer of anti-CCP antibody.CONCLUSIONThe migration and invasion abilities of FLS from anti-CCP antibody-positive RA patients are increased. Anti-CCP antibody is possibly correlated with the increased migration and invasion abilities of RA FLS.

Arthritis, rheumatoid; Anti-cyclic citrullinated peptide antibody; Fibroblast-like synoviocyte; Cell migration

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.12.027

1000- 4718(2013)12- 2277- 06

2013- 08- 15

2013- 11- 19

國家自然科學基金資助項目(No.81072484)；廣東省科技計劃(No.2010B080701099; No.2011B080701011);廣東省教育廳創新項目(No.2012KJCX0003)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8150; E-mail: lliuq@mail.sysu.edu.cn

# 現工作單位： 中山大學中山醫學院