硝態氮在綿羊瘤胃中的代謝途徑初探

內蒙古農業大學動物科學學院 石彩霞 侯先志

中國農業大學動物科技學院 孟慶翔＊周振明 任麗萍

Richardson 和 Watmought（1999）報道，硝態氮在厭氧環境下主要有三條代謝途徑，即同化作用、異化作用和反硝化作用。硝態氮同化還原和異化還原的中間產物均為亞硝酸鹽（），終產物均為銨（），但同化還原沒有的積累，NH4+也不會泌出細胞外。Lewis（1950）研究硝態氮在綿羊瘤胃內的代謝，發現首先被還原為，再被還原為，最后合成微生物蛋白，并且的積累隨添加量的增加而增加，證明硝態氮在瘤胃內遵循異化還原途徑，而非同化還原。一氧化二氮（N2O）和氮氣（N2）是硝態氮反硝化作用的重要中間產物和終產物。Jones（1972）采用體外法研究硝態氮在瘤胃的代謝時檢測到有少量N2O產生。Kaspar和Tiedje（1981）也發現硝態氮在牛瘤胃代謝會產生N2O和N2。因此，硝態氮在瘤胃內也可能存在反硝化還原途徑。動物適應硝態氮后不發生亞硝酸鹽中毒，是否是由于硝態氮在瘤胃內的代謝途徑發生變化，目前鮮見報道。因此，本試驗以綿羊為研究對象，研究其適應硝態氮前后，硝態氮在瘤胃內的代謝途徑，以揭示“適應”對硝態氮在瘤胃代謝規律的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液供體動物的飼養及日糧 6只安裝有永久性瘤胃瘺管的健康內蒙古半細毛綿羊為瘤胃液的供體動物，隨機分為2組，每組3只。對照組綿羊以1%的尿素和豆粕為主要氮源。試驗組綿羊用硝酸鉀（KNO3）逐漸替代尿素，第1周KNO3的飼喂量為0.75%，以后每周上升0.38%，直到喂量達到日糧干物質的2.27%，此時硝態氮完全取代尿素氮，待動物適應硝酸鉀1周后，作為瘤胃液的供體動物。

綿羊單籠飼養，每天 7∶00和 19∶00飼喂，自由飲水。日糧精粗比為30∶70，精料為混合精料，粗料為羊草?；A日糧組成及營養水平見表1。

表1 日糧組成及營養水平

1.2 體外產氣量試驗 體外試驗參照Menke（1979）的產氣量法。發酵底物以硝酸鉀為唯一氮源，可溶性淀粉和纖維素為碳源，它們在發酵底物中分別占14.4%、35.6%和50%，配制成粗蛋白質含量為12.5%的純合日糧，此時硝態氮在發酵底物中的含量為2%。于晨飼前分別采集對照組和試驗組綿羊的瘤胃內容物，用四層紗布過濾，過濾后的瘤胃液經CO2飽和，并將其與39℃預熱的緩沖液配制成1∶2的混合培養液。將0.2000 g（干物質基礎）發酵底物先稱好放入100 mL人工瘤胃培養管（德國 H?berle公司，HFT000025，有效體積100 mL，最小分度1 mL）并39℃預熱，將30 mL混合培養液用自動加樣器加入培養管中，放入水浴搖床39℃培養，每個處理3個重復，并設3個空白對照（Lin 等，2011）。

1.3 樣品的采集 于體外培養 0、2、4、6、8、12 h和24 h分別采集樣品，測定-N-N、氨態氮（NH3-N）和微生物氮（MN）的產量；體外培養24 h時采集氣體樣品，分別測定N2O和氫氣（H2）、CH4、二氧化碳（CO2）和 N2的濃度。

1.4 樣品的測定 采集的培養液于5400 r/min離心10 min，在1.5 mL離心管內準確加入1 mL上清液和0.2 mL含有內標物2 EB的25%（m/V）偏磷酸溶液，混勻，冰水浴中放置30 min，然后于12000 g離心10 min，取上清液用超濾膜過濾，然后采用戴安ICS-2500離子色譜測定-N和-N 的濃度（林淼等，2010）。

NH3-N濃度的測定參照Broderich和Kang（1980）的比色法，用尤尼柯2100-分光光度計測定。

由于本試驗發酵底物的氮源只有硝態氮，沒有其他蛋白氮，因此采用考馬斯亮藍法測定MN的含量（Cone 等，1997）。

N2O的測定參照鄒建文等（2002）的方法，用Agilent 4890D氣相色譜儀檢測，色譜柱采用1 m×2.2 mm（內徑）不銹鋼柱，內填80～100目 Proapack Q，載氣為高純N2，柱溫為55℃，檢測器為ECD，330℃，流速 30 mL/min。

H2、CH4、CO2和 N2的測定采用北京分析儀器公司的TP-2060T氣相色譜儀檢測，色譜柱采樣TDX-01填充柱，1 m×3 mm×2 mm；檢測器為 TCD，150℃；進樣口溫度150℃，柱溫120℃，載氣為氦氣，流速 50 mL/min，進樣量 0.1 mL（郭望山，2010）。

1.5 數據統計分析 數據經Excel處理后，采用SAS 9.0軟件單因素完全隨機設計GLM過程進行方差分析，瘤胃微生物來源以Tukey檢驗法進行多重比較，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.1表示有趨勢。

2 結果

0 （P=0.006）、2 （P=0.004）、4 h （P ＜0.0001）和 6 h（P=0.0004），試驗組的 NH3-N 濃度顯著高于對照組，8 h二者差異不顯著 （P=0.284），12 h（P=0.0002）和 24 h（P ＜ 0.0001）試驗組NH3-N濃度又顯著低于對照組。

表2 體外培養0～24 h-N、-N、NH3-N和MN濃度變化

表2 體外培養0～24 h-N、-N、NH3-N和MN濃度變化

項目 0 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 24 h 24 h占總氮比例/%NO3-N/（mg/L）110.64 67.08 51.58 38.94 24.27 2.58 0.27 0.2對照組試驗組SEM P值110.36 25.05 0.39 0.13 0.00 0.00 0.00 0.09.72 3.53 2.31 0.75 0.80 0.74 0.07 0.0040.974 ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001 0.013 0.009 0.009 NO2-N/（mg/L）0.00 0.00 0.00 2.15 5.19 0.34 0.00 0.0對照組試驗組SEM P值0.00 0.00 0.96 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00.00 0.00 0.16 0.26 1.48 0.13 0.00 0.00--0.002 0.001 0.001 0.033 - -NH3-N/（mg/L）16.47 50.79 39.24 40.44 64.01 89.70 100.83 80.0對照組試驗組SEM P值21.60 55.54 58.62 60.06 60.34 66.48 43.30 32.81.89 0.98 1.39 2.16 3.64 1.70 2.96 2.280.006 0.004 ＜0.0001 0.0004 0.284 0.0002 ＜0.0001 ＜0.0001 MN/（mg/L）0.00 1.99 40.23 53.19 26.35 24.57 18.90 15.0對照組試驗組SEM P值0.00 44.90 58.96 60.73 60.96 61.86 68.96 52.20.00 5.06 3.53 5.39 3.34 2.38 3.03 2.33-0.001 0.003 0.999 0.011 0.002 ＜0.0001 ＜0.0001總和占日糧氮的比例/%100 94 103 106 94 92 95對照組試驗組SEM P值100 95 96 92 92 93 850442322-0.288 0.365 0.003 0.140 0.243 0.002

除6 h （P=0.999） 外，2 （P=0.001）、4 （P=0.003）、8（P=0.011）、12 h（P=0.002）和 24 h（P ＜0.0001），試驗組的MN濃度均顯著高于對照組。

對 照 組在 0、2、4、6、8、12 h 和 24 h，NO3--N、-N、NH3-N和MN的總和占發酵底物總氮的92% ～ 106%；在發酵 24 h時，、、NH3-N和 MN的濃度分別為 0.27、0、100.83 mg/L和18.90 mg/L，占發酵底物總氮的0.2%、0%、80%和15%。試驗組在 0、2、4、6、8、12 h 和 24 h 時，-N、-N、NH3-N和MN的總和占發酵底物總氮的85% ～ 100%；在發酵24 h時，-N、-N、NH3-N和 MN的濃度分別為0、0、43.30 mg/L和68.96 mg/L，占發酵底物總氮的0%、0%、32.8%和52.2%。證明無論瘤胃微生物是否適應硝態氮，它在瘤胃的代謝途徑均以下面途徑為主：

由表3可見，試驗組和對照組的總產氣量（P=0.146）及 H2（P=0.737）、CH4（P=0.552）和 CO2（P=0.532）產量差異均不顯著，但試驗組N2產量顯著高于對照組（P=0.042）。

表3 體外培養24 h氣體的產量mL/g DM

3 討論

在本試驗中，NH3-N的濃度取決于-N的降解速度、-N的積累和MN的合成速度。雖然試驗組的MN合成速度顯著高于對照組（P＜0.05），但在培養的前8 h，試驗組的-N降解速度極顯著快于對照組（P＜0.01），又沒有-N積累，因此在體外培養的前6 h，試驗組的NH3-N濃度顯著高于對照組（P＜0.05）。然而，對照組的N-N在培養8 h濃度達到最高，有些微生物可能出現亞硝酸鹽中毒，影響了MN的合成，導致發酵后期對照組的NH3-N濃度又顯著高于試驗組（P ＜ 0.01）。

在體外培養過程中，除發酵6 h外，其他時間試驗組的MN濃度都顯著高于對照組（P＜0.05），這與試驗組瘤胃微生物適應硝態氮相一致。

反硝化是硝態氮在厭氧環境中的一條重要代謝途徑，中間產物主要為N2O，終產物為N2。在本試驗中體外培養24 h，沒有檢測到N2O，只檢測到少量的N2，并且試驗組的N2產量顯著高于對照組（P=0.042），但二者產量均不高。 Jones（1972）用體外法研究硝酸鹽代謝時發現，有少量的N2O產生，因此認為瘤胃存在反硝化作用。Kaspar和Tiedje（1981）采用N13和N15標記法研究硝酸鹽和亞硝酸鹽在牛瘤胃的還原過程，也檢測到有N2O和N2的產生，但研究認為這兩種物質不是硝酸鹽反硝化作用的產物，因為試驗使用了乙炔氣體在N2O水平上抑制反硝化作用，即用乙炔抑制N2O還原為N2，使來自反硝化作用的N2O產量不變或增加。然而 Kaspar和 Tiedje（1981）研究發現，將乙炔從5%增加到50%，并沒有增加N2O的產量，因此他認為N2O不是來自于瘤胃內硝酸鹽的反硝化作用，但他無法解釋為什么有N2產生。

試驗中雖然沒有檢測到N2O，但檢測到了N2，它是反硝化途徑的終產物。因此本研究認為，瘤胃可能存在一定的反硝化作用，因為土壤和植物中存在大量的反硝化細菌，它們很有可能隨飼料進入瘤胃，使瘤胃發生反硝化作用（Paul，2007）。試驗組的N2產量顯著高于對照組，可能是瘤胃微生物在適應硝態氮的過程中，促進了反硝化細菌的生長，使試驗組的N2產量增加，這也有利于抑制瘤胃N的產生。但在本試驗中N2的產量非常少，即使瘤胃內硝態氮存在反硝化作用，它也不是其主要的代謝途徑。

4 結論

本試驗結果表明，無論瘤胃微生物適應硝態氮與否，硝態氮在瘤胃的還原途徑均以異化還原為主，同時，可能存在一定的反硝化作用。

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